МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології і мікробіології КУРСОВА РОБОТА з дисципліни «Нормативне забезпечення біотехнологічних виробництв» на тему: «Одержання фітогормонів (гіберелінової кислоти) грибами роду Fusarium (Fusarium fujikuroi S109)» м. Київ - 2025 рік РЕФЕРАТ Курсова робота присвячена розробці технологічної схеми біосинтезу фітогормонів, зокрема гіберелінової кислоти, грибами роду Fusarium. Обраним біологічним агентом для дослідження є штам Fusarium fujikuroi S109, який показав високу здатність до синтезу фітогормонів, зокрема гіберелінів. Порівняння різних штамів та поживних середовищ дозволило обрати цей штам, оскільки він характеризується високою ефективністю при культивуванні та максимальними результатами щодо концентрації гіберелінів, що мають важливе значення для стимуляції росту рослин. Технологічна схема біосинтезу гіберелінової кислоти включає кілька етапів: підготовку та стерилізацію поживного середовища, вирощування інокуляту в колбах на качалках, перехід на виробничу стадію культивування у ферментері об’ємом 10 л з коефіцієнтом заповнення 0,5. Виробничий процес передбачає застосування переривчастої схеми культивування для досягнення високих концентрацій цільового продукту. У роботі також розглянуто контроль за процесом біосинтезу, включаючи мікробіологічний контроль, а також аналіз концентрації біомаси, гіберелінової кислоти та джерел Карбону і Нітрогену, що впливають на ріст та продуктивність гриба. Визначено ключові параметри, що забезпечують оптимальні умови для максимального синтезу фітогормонів. Курсова робота складається з вступу, п’яти розділів, списку використаних джерел та технологічної схеми. Загальний обсяг роботи – 46 сторінок, 1 рисунок, 11 таблиць. Ключові слова: гіберелінова кислота, Fusarium fujikuroi, біосинтез, культивування грибів, технологічна схема, мікробіологічний контроль, фітогормони. ЗМІСТ ВСТУП В останні десятиліття зростає попит на екологічно чисті та ефективні методи стимуляції росту рослин, що сприяє розвитку біотехнологічних процесів, пов’язаних із виробництвом фітогормонів. Одним із важливих напрямів є одержання гіберелінової кислоти, яка має значний вплив на процеси росту рослин, підвищує врожайність та стійкість до стресових факторів. Технології біосинтезу гіберелінів відкривають нові можливості для агропромисловості, фармацевтики та сільського господарства, що робить цю тему надзвичайно актуальною. Незважаючи на досягнення у галузі біотехнології, існують певні обмеження в існуючих методах синтезу фітогормонів, зокрема щодо ефективності біосинтезу, витрат на вирощування продуктів та використання дорогих поживних середовищ. Тому розробка нових технологій, що включають ефективні біологічні агенти та економічні поживні середовища, є необхідною для вдосконалення процесу виробництва гіберелінів. Для здійснення біосинтезу гіберелінової кислоти одним із перспективних біологічних агентів є Fusarium fujikuroi, гриб, який здатний продукувати гібереліни в значних кількостях. Цей агент виявився особливо ефективним завдяки своїм біохімічним властивостям, що дозволяють йому успішно синтезувати фітогормони в умовах лабораторного культивування. У курсовій роботі запропоновано вдосконалення технології біосинтезу гіберелінової кислоти шляхом використання штаму Fusarium fujikuroi S109. У рамках дослідження буде запропоновано новий склад поживного середовища для культивування цього біологічного агента, що забезпечить високу ефективність процесу синтезу при мінімальних витратах. Крім того, розглядається використання дешевших ростових субстратів, що дозволить знизити собівартість кінцевого продукту. Новизна курсової роботи полягає у впровадженні простого за складом поживного середовища для культивування Fusarium fujikuroi S109, що забезпечує високу продуктивність при мінімальних витратах. Також пропонується новий варіант технології біосинтезу, зокрема застосування двостадійного процесу культивування, що дозволить значно покращити ефективність синтезу гіберелінової кислоти, що дає можливість досягти значного зниження витрат на виробництво та підвищення економічної ефективності. Таким чином, робота має на меті розробити оптимізовану технологію виробництва гіберелінової кислоти, яка буде екологічно чистою, економічно вигідною та ефективною для використання в аграрній галузі. РОЗДІЛ 1. ОПИС ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ Продуктом біосинтезу Fusarium fujikuroi є гіберелінова кислота. Органолептичні показники. Гібелінова кислота - це безбарвна, кристалічна речовина, що не має вираженого запаху. Вона стабільна під час зберігання, але при впливі ультрафіолетового випромінювання може деградувати. Відсутність характерного запаху робить цей продукт легким для використання в агропромислових процесах, адже він не впливає на органолептичні якості кінцевої продукції. Гіберелінова кислота часто застосовується в умовах лабораторій і сільськогосподарських підприємств, де її фізичні та хімічні властивості дозволяють легко контролювати якість та ефективність використання в різних умовах. При цьому важливим аспектом є її здатність розчинятися в воді, метанолі та етанолі, що дає можливість використовувати різні методи її впровадження в процеси росту рослин [1, с. 38]. Хімічні властивості. Гіберелінова кислота має брутто-формулу C19H22O6 та молекулярну масу 390,38 г/моль. Вона є слабкою кислотою з пКа близько 5,8, що дозволяє ефективно працювати з нею в різних pH середовищах. Залежно від умов, гіберелінова кислота може гідролізуватися, утворюючи свої похідні, зокрема гібереліни, які також мають значний вплив на розвиток рослин. Ця властивість дозволяє налаштовувати технологічні процеси в аграрному секторі, підвищуючи ефективність використання препарату, зокрема для боротьби зі стресами у рослин. При цьому необхідно враховувати, що гіберелінова кислота має здатність утворювати комплекси з металами, що може змінювати її активність. Однак це також дає можливість додатково впливати на її ефективність шляхом модифікації умов застосування [2, с. 104]. Біологічна активність. Гіберелінова кислота є потужним регулятором росту рослин, активно стимулюючи процеси подовження стебел, розвитку кореневої системи та формування листя. Це дозволяє рослинам більш ефективно використовувати доступні ресурси, прискорюючи їх розвиток та зростання. Одним із важливих аспектів її дії є стимуляція проростання насіння, що дозволяє покращити схожість і рівномірність рослин. У разі застосування в стресових умовах (наприклад, при посусі чи недостатній освітленості) гіберелінова кислота сприяє збільшенню стійкості рослин, що дозволяє їм краще адаптуватися до несприятливих факторів навколишнього середовища. Крім того, вона допомагає прискорити цвітіння та дозрівання плодів, що сприяє підвищенню врожайності. Внаслідок цього гіберелінова кислота є важливим інструментом у сільському господарстві та агрохімії [3, с. 2]. Механізм біологічної дії. Механізм дії гіберелінової кислоти полягає в активації синтезу специфічних ензимів, які сприяють розширенню клітин і подовженню стебел. Це дає змогу рослинам швидше досягати фізіологічної зрілості, що особливо важливо для підвищення їх продуктивності. Також гіберелінова кислота впливає на процеси формування кореневої системи, що покращує поглинання води та поживних речовин. Її застосування дозволяє активізувати ріст рослин навіть в умовах, коли інші методи стимуляції росту не є такими ефективними. Тому гіберелінова кислота має великий потенціал в аграрному секторі, де її застосування може стати значним чинником у покращенні врожайності та стійкості культур до різноманітних стресів [4, с. 1]. Сфери застосування. Гіберелінова кислота знаходить широке застосування в сільському господарстві, зокрема для стимулювання росту рослин у стресових умовах. Вона активно використовується в селекційних програмах для поліпшення властивостей сортів та підвищення врожайності. Крім того, гіберелінова кислота застосовується для обробки насіння, що забезпечує його швидше проростання та підвищену схожість. В агрохімії її використовують для підвищення стійкості рослин до екологічних стресів, таких як посуха, заморозки або хвороби. Враховуючи всі ці переваги, гіберелінова кислота є важливим компонентом у розвитку сучасних агропромислових технологій, сприяючи поліпшенню врожайності та якості сільськогосподарських культур [5, с. 473]. Завдяки своїй біологічній активності та широкому спектру застосування, гіберелінова кислота є важливим компонентом у розвитку агропромисловості та сільського господарства. РОЗДІЛ 2. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА, СКЛАДУ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ 2.1 Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування Один з важливих аспектів у виборі біологічного агента — це ефективність біосинтезу гіберелінової кислоти, яка повинна бути максимально високою при мінімальних витратах на культивування. Багато мікроорганізмів можуть синтезувати гіберелінову кислоту, однак для досягнення високих рівнів продуктивності необхідно обрати такий штам, який володіє оптимальними характеристиками щодо швидкості росту і синтезу біологічно активної речовини. Порівняно з іншими можливими агентами, гриб Fusarium fujikuroi S109 демонструє високі результати щодо швидкості синтезу гіберелінової кислоти та здатний функціонувати в умовах простих і економічно вигідних поживних середовищ. Важливим аспектом є також стійкість цього штаму до контамінації, що забезпечує стабільність виробничих процесів. Для вибору найефективнішого біологічного агента і найбільш підходящих умов культивування було здійснено систематизацію наукової та патентної літератури, що дало змогу порівняти різні мікроорганізми, використовувані в біотехнології для виробництва гіберелінової кислоти. Далі наведено три таблиці, що ілюструють характеристики різних біологічних агентів і середовищ, на яких їх можна культивувати. Характеристики штамів Fusarium та їх біосинтетичні властивості наведені в табл. 2.1 Таблиця 2.1 Особливості одержання фітогормонів (гіберелінової кислоти) грибами роду Fusarium Розрахунок вартості компонентів поживних середовищ для культивування штамів Fusarium представлено в табл. 2.2. Таблиця 2.2 Вартість компонентів поживного середовища для культивування F. moniliforme Sheldon, Fusarium fujikuroi S109, Fusarium moniliforme ATCC 10052 *Примітка: Ціни наведено станом на травень2025 р. (Додаток А) Кожен компонент зазначено з його концентрацією в середовищі (г/л), ціною за кілограм (грн/кг), а також вартістю для приготування 1 літра середовища. Джерела інформації надані у вигляді порядкових номерів для прайс-листів та електронних ресурсів. Вартість 1 літра поживного середовища варіюється від 4,14 грн для Fusarium moniliforme ATCC 10052 до 14,45 грн для Fusarium fujikuroi S109, що дозволяє оцінити економічну доцільність використання кожного середовища залежно від потреб виробництва гіберелінової кислоти. Умовну вартість цільового продукту для різних штамів Fusarium та кількість утвореного гібереліну за годину наведено в табл. 2.3. Таблиця 2.3 Умовна вартість цільового продукту (гіберелінів) при культивуванні Fusarium moniliforme Sheldon, Fusarium fujikuroi S109, Fusarium moniliforme ATCC 10052 На основі даних, наведених у таблиці 2.3, найефективнішим біологічним агентом для біосинтезу гіберелінової кислоти є штам Fusarium fujikuroi S109. 2.2 Перевірочний розрахунок складу поживного середовища Для проведення розрахунку враховуються вимоги до складу поживних середовищ, хімічний склад мікробної клітини та показники біосинтезу, такі як концентрація біомаси та цільового продукту. Тривалість культивування становить 168 год, концентрація гіберелінової кислоти в культуральній рідині становить 1,16 г/л, а концентрація біомаси – 5 г/л. Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення. Потреби для синтезу біомаси. Вуглець є основним елементом для утворення клітинної маси мікроорганізмів. При розрахунку потреби для синтезу біомаси можна використати співвідношення, що на кожні 100 г вуглецю утворюється близько 50 г біомаси (якщо це 50% від сухої маси клітини). Оскільки необхідно отримати 5 г/л біомаси, потреба у вуглеці для синтезу біомаси буде: Потреба у вуглеці = = 10 г/л вуглецю Потреби для синтезу гіберелінової кислоти. Гіберелінова кислота, як і інші біологічно активні речовини, вимагає певної кількості вуглецю для свого синтезу. Для її синтезу на кожні 1 г гібереліну потрібно близько 0,5 г вуглецю. Тому для синтезу 1,16 г/л гіберелінової кислоти потреба у вуглеці складе: Потреба у вуглеці=1,16г×0,5=0,58 г/л вуглецю Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення. Потреби для синтезу біомаси. Азот є необхідним для синтезу амінокислот та білків у мікроорганізмах. Припустимо, що на кожні 100 г азоту мікроорганізми утворюють 100 г біомаси (за умови, що азот є основним елементом для формування клітинної маси). Для утворення 5 г біомаси потрібно: Потреба в азоті = = 5 г/л азоту Потреби для синтезу гіберелінової кислоти. Синтез гіберелінової кислоти також потребує азот, але в значно меншій кількості. Для кожного грама гібереліну потрібно близько 0,1 г азоту. Тому для синтезу 1,16 г/л гіберелінової кислоти потреба в азоті буде: Потреба в азоті=1,16г×0,1=0,116 г/л азоту Розрахунок вмісту органічного азоту в сечовині та в кукурудзяній макусі. Сечовина є основним джерелом азоту у середовищі. З концентрацією сечовини 0,15 г/л та молекулярною масою сечовини (60 г/моль), вміст азоту в сечовині можна розрахувати як: Азот в сечовині = * 14 г/моль = 0,035г азоту/л Для кукурудзяної макухи, яка також є джерелом азоту, концентрація 5 г/л дає наступну кількість азоту: Азот в кукурудзяній макусі=5г/л×0,05=0,25г азоту/л Розрахунок вмісту у середовищі джерел мінерального азоту. Джерелами мінерального азоту є сульфат амонію, сечовина та інші амонійні сполуки. Враховуючи, що азот в амонійному вигляді необхідний для синтезу амінокислот, він активно використовуватиметься для утворення біомаси. Розрахунок складу мелясно-сольового підживлювального розчину. У вигляді підживлювального розчину в середовище необхідно внести у процесі культивування продуцента Fusarium fujikuroi S109 20 г/л мелясу та 10,87 г/л сечовини. Тривалість культивування становить 168 год. Приймемо, що підживлення додається у середовище кожні 24 год. Тоді кількість порцій підживлення становить: К-сть порцій підживлення = = 7 порцій Отже, з кожною порцією підживлення у середовище повинно вноситись: Меляс = = 2,86 г/л Сечовина = = 1,55 г/л Таким чином, кожна порція підживлення повинна містити 2,86 г/л мелясу та 1,55 г/л сечовини, що забезпечить необхідні умови для ефективного росту і синтезу гіберелінової кислоти. Розрахунок вмісту Фосфору у середовищі. Фосфор необхідний для синтезу нуклеотидів та фосфоліпідів, що є важливими компонентами клітинних мембран і ДНК. В середовищі для біосинтезу гіберелінової кислоти основним джерелом фосфору є фосфати, зокрема калійні або магнієві солі фосфатної кислоти. Потреби для синтезу біомаси. Фосфор є важливим елементом для синтезу клітинної маси. Для кожної одиниці біомаси необхідно близько 0,3 г фосфору. Таким чином, для синтезу 5 г/л біомаси потрібно: Потреба в фосфорі для біомаси=5г×0,3=1,5г/л фосфору Потреби для синтезу гіберелінової кислоти. Для синтезу гіберелінової кислоти на кожний грам гібереліну потрібно 0,02 г фосфору. Таким чином, для 1,16 г/л гіберелінової кислоти: Потреба в фосфорі для гіберелінової кислоти=1,16г×0,02=0,0232г/л  Загальна потреба у фосфорі для середовища складе: Загальна потреба в фосфорі=1,5г/л+0,0232г/л=1,5232г/л фосфору Інші компоненти середовища. Окрім основних компонентів, таких як джерела вуглецю та азоту, в середовищі необхідні також мінеральні елементи, які підтримують ферментативну активність та інші біохімічні процеси. Сульфур – необхідний для синтезу амінокислот (метіонін, цистеїн) і вітамінів, тому його концентрація в середовищі повинна складати близько 0,5 г/л. Магній та кальцій – використовуються для активації ферментів та стабілізації структури мембран. Вони повинні бути присутніми в середовищі в концентрації 0,2–0,5 г/л. Калій – важливий для стабільності мембран і забезпечення осмотичного балансу, його концентрація повинна становити 0,5–1,0 г/л. Розрахунок кількості аміачної води для нейтралізації культуральної рідини. Аміачна вода використовується для корекції pH середовища, зокрема для нейтралізації кислотності, яка може утворюватися під час біосинтезу. Для цього потрібно розрахувати, скільки аміачної води потрібно додати до культуральної рідини. Потреби для корекції pH. Якщо pH культурального середовища падає нижче оптимального рівня (приблизно 5,5), додавання аміачної води дозволяє відновити кислотно-лужний баланс. Для корекції pH середовища на 1 л зазвичай потрібно близько 10–15 мл аміачної води, що відповідає концентрації амонійних іонів у розчині. Розрахунок обсягу аміачної води. Якщо в середовищі для Fusarium fujikuroi S109 потрібно нейтралізувати 1 л культуральної рідини, для цього достатньо буде додати: Обсяг аміачної води=10мл/л Таким чином, для корекції pH в 1 л середовища знадобиться 10 мл аміачної води. Склад поживного середовища для культивування продуцента лізину, включаючи вміст компонентів у підживлювальному розчині та порціях підживлення, наведено в табл. 2.4. Таблиця 2.4 Склад поживного середовища для культивування продуцента лізину РОЗДІЛ 3. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ 3.1 Вибір умов і способу культивування Процес біосинтезу здійснюється в аеробних умовах, оскільки для активного росту та метаболічної активності мікроорганізмів необхідний кисень. Враховуючи оптимальний pH для цього штаму в межах 5,0–5,5, можливе використання умовно асептичних або неасептичних умов культивування, що дозволяє знизити витрати на стерилізацію середовища. Процес біосинтезу вимагає підживлення, оскільки для синтезу гіберелінової кислоти необхідна висока концентрація субстрату (вуглецю та азоту). Використання підживлення дозволяє підтримувати оптимальну концентрацію компонентів поживного середовища протягом всього процесу культивування, що сприяє більш ефективному синтезу метаболітів. Для цього процесу обрано глибинне культивування, оскільки воно забезпечує рівномірний доступ до поживних речовин та кисню в культуральній рідині. Такий метод дозволяє досягти високої продуктивності процесу біосинтезу гіберелінової кислоти. Оптимальним способом культивування є періодичне культивування, оскільки синтез гіберелінів активно відбувається в стаціонарній фазі росту, а з безперервним культивуванням продуктивність може знижуватися через підтримку постійного середовища з високим рівнем субстрату. Параметри культивування повинні бути оптимізовані для цього штаму: pH середовища має становити 5,0–5,5, температура культивування — 28–30°С. Аерація є необхідною для забезпечення постійного доступу кисню до клітин, а перемішування забезпечить рівномірний розподіл поживних речовин і кисню в культуральній рідині. Таким чином, для найбільш ефективного біосинтезу гіберелінової кислоти обрано аеробне, умовно асептичне культивування з підживленням, методом глибинного культивування та періодичним внесенням підживлювальних розчинів, що забезпечить оптимальні умови для високої продуктивності і синтезу гіберелінової кислоти. 3.2 Вибір типу ферментера Для забезпечення ефективного біосинтезу гіберелінової кислоти та оптимальних умов культивування штаму Fusarium fujikuroi S109 необхідно ретельно обрати тип ферментера, враховуючи всі особливості процесу та біологічного агента. Вибір ферментера визначається кількома факторами, серед яких важливими є рівень аерації, інтенсивність перемішування та можливий вплив надлишкових зрізових зусиль перемішувального пристрою на фізіологічні властивості мікроорганізму. Оскільки Fusarium fujikuroi S109 є мікроорганізмом, який утворює міцелій, надлишкові зрізові зусилля, створювані інтенсивним перемішуванням, можуть негативно впливати на його ріст і синтез гіберелінової кислоти. Занадто інтенсивне перемішування може призвести до дисфункції клітин та зниження ефективності процесу. Одним із найкращих варіантів для культивування Fusarium fujikuroi S109 є ферментер з регульованим перемішуванням, який дозволяє варіювати швидкість обертання перемішуючого пристрою в залежності від фаз процесу. На початкових етапах культивування, коли концентрація біомаси низька, перемішування може бути інтенсивнішим, знижуючи ризик утворення мікроагрегатів та забезпечуючи рівномірний розподіл поживних речовин. Під час пізніх стадій культивування, коли кількість біомаси збільшується, швидкість обертів може бути знижена, що допомагає зменшити зрізові зусилля та зберегти цілісність міцелію. Крім того, важливо враховувати потреби Fusarium fujikuroi S109 у кисні, оскільки це аеробний мікроорганізм, для нормального розвитку якого необхідна постійна подача розчиненого кисню. Тому ферментер повинен мати систему інтенсивної аерації, яка забезпечить рівномірний розподіл кисню по всьому об’єму культуральної рідини. Інтенсивність аерації та перемішування повинна бути оптимальною, щоб забезпечити необхідний рівень масопереносу кисню без пошкодження клітин. Для оптимізації процесу біосинтезу гіберелінової кислоти рекомендовано використовувати ферментер з двома системами перемішування: одна система для забезпечення високої аерації на початку процесу та інша для підтримки більш низької швидкості перемішування на пізніх стадіях. Це дозволить не тільки підтримувати високий рівень кисню, але й забезпечити м’яке перемішування, яке не буде шкодити міцелію мікроорганізмів. У результаті, вибір ферментера з регульованою швидкістю обертання перемішувального пристрою і налаштування оптимальної інтенсивності аерації дозволять досягти максимальної ефективності процесу біосинтезу гіберелінової кислоти при мінімальних витратах енергії та з максимальною продуктивністю. 3.3 Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу для культивування Fusarium fujikuroi S109 для біосинтезу гіберелінової кислоти проводиться на основі обраного виробничого ферментера, коефіцієнта заповнення та дози інокуляту. Розглянемо, як визначити кількість стадій та об’єм посівного матеріалу. Визначення робочого об'єму ферментера Вибір об'єму ферментера залежить від типу цільового продукту. Для біосинтезу гіберелінової кислоти використовуватимемо ферментер об'ємом 50 м³ (загальноприйнятий об'єм для процесів біосинтезу органічних кислот і метаболітів). Коефіцієнт заповнення ферментера становить 0,6. Робочий об'єм ферментера (Vроб) розраховуємо за формулою: Vроб=Vг.ф.×Kзап де: Vг.ф.=50 м3 — геометричний об'єм ферментера; Kзап=0,6 — коефіцієнт заповнення. Vроб=50×0,6=30м3 Розрахунок кількості посівного матеріалу Доза посівного матеріалу для культивування повинна становити 10% від об'єму культуральної рідини. Отже, для одержання 30 м³ культуральної рідини необхідно: Vроб.1=30×0,1=3м3 посівного матеріалу Розрахунок об'єму ферментера для отримання інокуляту Для підготовки 3 м³ посівного матеріалу використовуємо стандартний інокулятор об'ємом 5 м³. Оскільки на кожну стадію додається 10% від об'єму, то об'єм посівного матеріалу для одержання 3 м³ культуральної рідини буде: Vроб.2=30×0,1=0,3м3 посівного матеріалу Цю кількість інокуляту можна отримати в інокуляторі об'ємом 0,63 м³. Розрахунок кількості посівного матеріалу на наступну стадію Далі розраховуємо, скільки інокуляту буде потрібно для одержання 300 л культуральної рідини. Якщо для цієї кількості культуральної рідини потрібно 0,3 м³ посівного матеріалу, то на наступній стадії процесу: Vроб.3=300×0,1=30л посівного матеріалу Для приготування цієї кількості інокуляту буде достатньо інокулятора об'ємом 0,06 м³. Розрахунок посівного матеріалу для першої стадії Щоб приготувати 30 дм³ культуральної рідини, необхідно ввести 3 дм³ посівного матеріалу. Для цієї кількості посівного матеріалу об’єм інокулятора складе: Vроб.4=30×0,1=3дм3 посівного матеріалу Таку кількість посівного матеріалу можна приготувати в інокуляторі об'ємом 5 дм³. Остання стадія: приготування посівного матеріалу в колбах Для приготування 3 дм³ культуральної рідини необхідно 300 мл посівного матеріалу. Цю кількість інокуляту можна отримати культивуванням мікроорганізмів у колбах на качалці. Отже, для цієї кількості інокуляту достатньо використати колби на качалці об'ємом 2 л. Результати розрахунку об’ємів ферментаційного обладнання для підготовки посівного матеріалу та виробничого біосинтезу наведені в табл. 3.1. Таблиця 3.1 Результати розрахунку об’ємів ферментаційного обладнання для підготовки посівного матеріалу і виробничого біосинтезу На рис. 3.1 представлено послідовність етапів підготовки посівного матеріалу для культивування Fusarium fujikuroi S109 у виробничому ферментері об’ємом 50 м³. Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу включає використання інокуляторів різних об’ємів для приготування необхідної кількості інокуляту на кожному етапі процесу культивування. Початково приготований посівний матеріал використовуються для вирощування в наступних інокуляторах, з поступовим збільшенням об’єму культуральної рідини до отримання остаточного об'єму в виробничому ферментері. Рис. 3.1 Схема приготування посівного матеріалу для біосинтезу гіберелінової кислоти за допомогою Fusarium fujikuroi S109 3.4 Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для одержання посівного матеріалу і виробничого біосинтезу Для виробничого біосинтезу гіберелінової кислоти за допомогою Fusarium fujikuroi S109 використовується поживне середовище, яке має наступний склад (г/л): Меляс — 20 г/л (джерело вуглецю) Сечовина — 10,87 г/л (джерело азоту) KH₂PO₄ (фосфат калію) — 1,95 г/л (джерело фосфору) Сульфат магнію (MgSO₄) — 0,12 г/л (джерело сульфуру) Калій (K₂SO₄) — 0,5 г/л (джерело калію) Магній (MgSO₄) — 0,2 г/л (джерело магнію) Сульфат заліза (FeSO₄) — 0,005 г/л (джерело заліза) Особливості приготування і стерилізації середовища Під час підготовки поживного середовища для виробничого біосинтезу, компоненти середовища об’єднуються в композиції для забезпечення оптимальних умов стерилізації: Меляс та сечовина можуть бути стерилізовані разом, оскільки ці компоненти не схильні до утворення нерозчинних осадів при стерилізації. Солі кальцію, магнію та фосфати мають бути стерилізовані окремо для уникнення утворення нерозчинних фосфатів кальцію і магнію. У випадку їх об'єднання необхідно довести pH до 4,5-5,0 перед стерилізацією. Карбонат кальцію, що використовується для корекції pH, стерилізується окремо і переноситься в ферментер після стерилізації та охолодження. Підготовка середовища здійснюється з використанням питної води, що забезпечує оптимальні умови для росту Fusarium fujikuroi S109 та максимальну ефективність біосинтезу гіберелінової кислоти. Вода повинна бути достатньо чистою для повного розчинення компонентів і уникнення їх забруднення. Стерилізація Автоклавування — стерилізація середовища відбувається при температурі 131°C, якщо компоненти не включають термолабільні речовини. У разі необхідності стерилізації при 112°C, це здійснюється в окремому реакторі. Стерилізація солей та підкислення середовища — перед подачею в ферментер, солі повинні бути розчинені при перемішуванні, а pH доведено до оптимального рівня (4,5-5,0) за допомогою 6%-го розчину соляної кислоти. Таким чином, приготування і стерилізація поживного середовища є важливим етапом, що визначає ефективність біосинтезу гіберелінової кислоти. Правильне розділення компонентів середовища на композиції, а також належні умови стерилізації забезпечують максимальний результат і мінімізацію втрат компонентів. 3.4.1 Вирощування інокуляту в колбах на качалках Проаналізувавши склад поживного середовища для вирощування Fusarium fujikuroi S109 для біосинтезу гіберелінової кислоти, ми умовно ділимо його на кілька композицій, залежно від режиму стерилізації компонентів. Такий поділ необхідний для запобігання утворенню осадів і забезпечення ефективної стерилізації кожного компонента окремо. Композиція А. До цієї композиції входять компоненти, які можна стерилізувати разом, оскільки вони не утворюють осадів і не мають значної термолабільності. Компоненти: Меляс, сечовина, глюкоза Режим стерилізації: Стерилізація при температурі 112-115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20-30 хвилин. Це оптимальні умови для стерилізації цих компонентів, оскільки вони не схильні до утворення нерозчинних осадів і не руйнуються при таких температурах. Композиція Б. Вона включає компоненти, які мають схильність до утворення осадів під час стерилізації, тому вони стерилізуються окремо від інших компонентів. Компоненти: Сульфат магнію, сульфат калію Режим стерилізації: Стерилізація при температурі 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хвилин. Ці солі потребують більш інтенсивних умов стерилізації, оскільки вони можуть утворювати нерозчинні осади, якщо стерилізувати їх разом із іншими компонентами. Композиція В. Ця композиція включає фосфати та карбонат кальцію, які також мають різні вимоги до стерилізації. Компоненти: Фосфати (наприклад, KH₂PO₄), карбонат кальцію Режим стерилізації: Стерилізація при температурі 120°C під тиском 0,1 МПа. Карбонат кальцію завжди стерилізується окремо, оскільки він використовується для регуляції pH середовища. Фосфати можуть бути стерилізовані разом із карбонатом кальцію, якщо пH середовища в процесі стерилізації довести до 4,5–5,0. 3.4.2 Вирощування інокуляту в посівних апаратах Стерилізація певних обсягів поживного середовища, необхідних для вирощування інокуляту в посівних апаратах, вимагає правильного розподілу компонентів на композиції. Це дає можливість уникнути утворення осадів і забезпечити ефективну стерилізацію кожного компонента в умовах посівного апарата. Враховуючи різні вимоги до стерилізації компонентів середовища, їх об'єднують у композиції, що дозволяє досягти найкращого результату. Стерилізація композиції А відбувається в посівному апараті, оскільки умови стерилізації цієї композиції є м'якшими й менш агресивними порівняно з композицією Б. Для композиції А температура стерилізації становить 112–115°C, а тиск - 0,05 МПа, що є оптимальними умовами для її стерилізації в посівному апараті. Вона не потребує таких суворих умов, тому стерилізація її разом із іншими компонентами в посівному апараті є доцільною. Стерилізація композиції Б проводиться окремо, оскільки її компоненти потребують більш високих температур і тиску для ефективної стерилізації. При спільній стерилізації з іншими компонентами вони можуть утворювати нерозчинні осади, тому для забезпечення належного результату стерилізація цієї композиції здійснюється в умовах, де температура і тиск є вищими. 3.4.3 Виробничий біосинтез Для ефективного біосинтезу гіберелінової кислоти за допомогою Fusarium fujikuroi S109 у ферментаторі, поживне середовище поділяється на кілька композицій. Кожна композиція має свої специфічні умови стерилізації, що дозволяє оптимізувати процес підготовки середовища, уникнути утворення осадів та забезпечити максимальну ефективність біосинтезу. Розподіл на композиції виглядає наступним чином: Композиція А включає основні джерела вуглецю та азоту для мікроорганізмів. До її складу входять: Меляс (C₆H₁₂O₆) — основне джерело вуглецю. Сечовина (NH₂CONH₂) — джерело азоту. Глюкоза (C₆H₁₂O₆) — додаткове джерело вуглецю для оптимізації росту мікроорганізмів. Режим стерилізації цієї композиції здійснюється при температурі 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20–30 хвилин. Оскільки компоненти композиції не схильні до утворення осадів та мають стабільність при таких умовах стерилізації, їх можна стерилізувати разом без шкоди для їх функцій у середовищі. Композиція Б містить мінеральні компоненти, які відіграють важливу роль у метаболізмі мікроорганізмів, забезпечуючи їх необхідними мікроелементами: Сульфат магнію (MgSO₄·7H₂O) — джерело магнію. Сульфат калію (K₂SO₄) — джерело калію. Фосфат калію (KH₂PO₄) — джерело фосфору. Режим стерилізації цієї композиції здійснюється при температурі 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40–60 хвилин. Високі температури і тиск необхідні для того, щоб ефективно стерилізувати ці компоненти, адже при більш низьких температурах можуть утворюватися нерозчинні осади, які знижують ефективність середовища. У табл. 3.2 наведено розрахунок вмісту основних компонентів поживного середовища, які використовуються для культивування Fusarium fujikuroi S109 для біосинтезу гіберелінової кислоти. Залежно від об’єму середовища, компоненти пропорційно збільшуються, а умови приготування та стерилізації залишаються незмінними для всіх етапів. Розрахунок вмісту мікроелементів у різних об’ємах поживного середовища представлений у табл. 3.3 Таблиця 3.2 Розрахунок вмісту та особливості приготування деяких компонентів поживного середовища для біосинтезу гіберелінової кислоти за допомогою Fusarium fujikuroi S109 Таблиця 3.3 Розрахунок вмісту мікроелементів в різних об’ємах поживного середовища РОЗДІЛ 4. ОПИС ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ Кожна стадія та операція процесу мають свої порядкові номери, що дозволяє чітко слідкувати за виконанням технології. Опис включає підготовку та стерилізацію поживного середовища, вирощування інокуляту, основний біосинтез, а також обробку відходів. Підготовка поживного середовища є першою стадією технологічного процесу. На цьому етапі розраховується кількість компонентів, які необхідно додати для приготування середовища, а також обчислюється об'єм води для розчинення цих компонентів. Компоненти поживного середовища поділяються на композиції, враховуючи умови стерилізації [9, с. 238]. Після цього середовище стерилізується в залежності від температури та тиску, що потрібні для кожного компоненту. Наприклад, меляс, сечовина та глюкоза стерилізуються при температурі 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20–30 хвилин, а сульфат магнію та фосфати — при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40–60 хвилин [6, с. 431]. Після підготовки поживного середовища наступною стадією є вирощування інокуляту. Спочатку інокулят вирощується в колбах на качалках, де підтримується оптимальна температура та аерація. Після цього, інокулят переноситься в посівні апарати, де обсяг культури поступово збільшується для подальшого використання у виробничому ферментері. Цей етап потребує чіткої регуляції параметрів середовища, таких як температура, pH та рівень аерації, для забезпечення оптимальних умов для росту мікроорганізмів [14, с. 203]. Основний біосинтез гіберелінової кислоти здійснюється у ферментаторі, об'ємом 50 м³. Поживне середовище, яке було підготовлене та стерилізоване, подається в ферментер, де мікроорганізми активно ростуть та виробляють цільовий продукт. Протягом цього процесу здійснюється додавання підживлення для підтримки потрібної концентрації субстратів, що є необхідними для біосинтезу. Крім того, постійно контролюється pH середовища, яке при потребі коригується за допомогою стерильних розчинів кислоти чи лугу [12, с. 628]. Після завершення процесу біосинтезу відбувається стадія переробки відходів. На цьому етапі зібрані відходи, такі як невикористані компоненти середовища, продукти метаболізму мікроорганізмів і частки самих мікроорганізмів, піддаються обробці. Визначаються методи їх утилізації або повторного використання в подальших етапах виробництва [7, с. 474]. Останньою стадією є знешкодження відходів, що утворилися в результаті біосинтезу. Ці відходи можуть містити токсичні елементи, які потребують спеціального знешкодження. Для цього використовуються методи хімічного нейтралізування або біологічного очищення, що забезпечує безпечну утилізацію відходів [11, с. 533]. Табл. 4.1 демонструє розрахунок необхідних кількостей компонентів для приготування 3 л середовища для вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці. Вміст кожного компонента наведено в г/л, а також розрахована кількість для 3 л середовища. Також зазначено, до якої композиції належить кожен компонент (А або Б) і об’єм відповідної композиції в літрах. Таблиця 4.1 Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці Приготування і стерилізація композиції А Процес приготування композиції А починається з того, що на технічних терезах зважуються необхідні компоненти. Після цього компоненти поміщають у колбу об’ємом 3 л, додають 1,4 л дистильованої води і перемішують до повного розчинення. Колбу закривають ватно-марлевим корком і стерилізують в автоклаві при температурі 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20–30 хвилин. Після стерилізації композиція охолоджується до кімнатної температури, і вона готова для використання в процесі вирощування інокуляту та біосинтезу. Приготування і стерилізація композиції Б Процес приготування композиції Б починається з того, що на технічних терезах зважуються сульфат магнію, сульфат калію та амонійні солі. Після зважування компоненти поміщають у колбу об’ємом 3 л, додають 1,4 л води питної та перемішують до повного розчинення. Колбу закривають ватно-марлевим корком і стерилізують в автоклаві при температурі 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40–60 хвилин. Після стерилізації композиція охолоджується і готова для використання на наступних етапах вирощування інокуляту. Приготування і стерилізація композиції В Приготування композиції В починається з того, що в лабораторний стаканчик об’ємом 250 мл вносять мелясу і теплою водою розчиняють її. Після перемішування розчин переносять у колбу об’ємом 250 мл, додають додаткову кількість води та регулюють рН до 4,0 за допомогою 1 н розчину H₂SO₄. Потім колбу закривають ватно-марлевим корком. Приготовану композицію стерилізують в автоклаві при температурі 112°C протягом 30 хвилин. Після стерилізації композиція охолоджується і готова до використання для подальшого біосинтезу. Розрахунок необхідних кількостей компонентів для приготування середовища для вирощування інокуляту в інокуляторі об’ємом 31,5 л наведений у табл. 4.2, де представлено склад композицій та відповідні об’єми для кожного компонента. Таблиця 4.2 Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в інокуляторі об’ємом 31,5 л (Кз = 0,6) Підготовка посівного матеріалу Процес підготовки починається з того, що на агаризоване поживне середовище, яке складається з пшеничних висівок і солей, переноситься культура Fusarium fujikuroi S109. Використовують метод виснажувального штриха для переносу культури на нову чашку Петрі. Культури вирощуються в термостаті при температурі 28°C протягом 48 годин до утворення чітко видимих колоній. Потім для подальшого вирощування відбираються ізольовані колонії, що не мають ознак контамінації. Підтримання колекційної культури Після виділення ізольованих колоній культура переноситься на нові агаризовані середовища для підтримки життєздатності і поповнення запасів культури. Для цього культури Fusarium fujikuroi S109 періодично перенаправляються на свіжі середовища, що містять необхідні поживні речовини, такі як глюкоза, сечовина та інші макро- та мікроелементи. Культури вирощуються в термостаті при 28°C до стабільного росту. Одержання робочої культури Для отримання робочої культури з колекційної культури гриба, з агаризованих середовищ культура переноситься на рідкі поживні середовища, що містять органічні та неорганічні компоненти, оптимальні для росту Fusarium fujikuroi S109. В процесі вирощування робочої культури контролюються важливі параметри середовища: температура (28°C), pH (5,5) та рівень аерації. Культура активно росте в рідкому середовищі, і на цій стадії ми отримуємо великий обсяг біомаси, готовий до подальшого біосинтезу гіберелінової кислоти. Вирощування інокуляту на агаризованих поживних середовищах Після того, як культура розмножується на рідкому середовищі, інокулят переноситься на агаризовані середовища для подальшої ізоляції і забезпечення чистоти культури. На агаризованих середовищах культура Fusarium fujikuroi S109 вирощується в термостаті при 28°C протягом 48 годин до досягнення активного росту, що дозволяє ізолювати здорові колонії для подальшого перенесення на середовище для біосинтезу гіберелінової кислоти. Вирощування інокуляту в колбах на качалках Інокулят, вирощений на агаризованому середовищі, переноситься в колби на качалки, де культура постійно перемішується для забезпечення рівномірної аерації. Це важливий етап, на якому мікроорганізми активно поглинають поживні речовини, що дозволяє їм досягти максимальної продуктивності. Температура в колбах підтримується на рівні 28°C, а рівень кисню контролюється для забезпечення оптимального росту. Вирощування інокуляту в інокуляторі Після досягнення необхідної кількості біомаси інокулят переноситься в інокулятор, де він росте в більших обсягах середовища. В інокуляторі створюються ідеальні умови для активного росту Fusarium fujikuroi S109 завдяки регульованому рівню кисню, температурі 28°C, аерації та перемішуванню. Під час цього етапу також здійснюється контроль за pH середовища, що дозволяє забезпечити оптимальні умови для максимального біосинтезу гіберелінової кислоти. Виробничий біосинтез (отримання культуральної рідини) Процес виробничого біосинтезу починається з того, що підготовлений інокулят, що вирощувався на попередніх етапах, переноситься в ферментер об’ємом 50 м³. Тут культура вирощується на рідкому середовищі, яке складається з мелясу, сечовини, глюкози та мінеральних солей, що забезпечують мікроорганізми усіма необхідними поживними речовинами для синтезу гіберелінової кислоти. У ферментері підтримується оптимальна температура 28°C, pH — 5,5, аерація та перемішування середовища для забезпечення належної інтенсивності масопереносу кисню. Процес триває протягом 96 годин. Після завершення процесу біосинтезу культуральна рідина збирається з ферментера. Вона містить значну кількість гіберелінової кислоти, яка була синтезована грибом Fusarium fujikuroi S109. Фільтрація та відокремлення клітин Після закінчення біосинтезу культуральна рідина проходить через фільтраційний процес для відокремлення клітин грибів від рідкої фази. Використовуються фільтри з пористістю 0,45 мкм, що дозволяє ефективно відділити мікроорганізми від рідкого середовища. Отриманий фільтрат містить розчинену гіберелінову кислоту, що необхідно подальше очищення. Очистка та концентрація гіберелінової кислоти Після фільтрації рідину піддають процесу очищення, який включає кілька стадій екстракції та концентрування гіберелінової кислоти. Для цього використовуються хроматографічні колонки або методи екстракції органічними розчинниками. В результаті очищення гіберелінова кислота концентрується в розчині до бажаної концентрації. Нейтралізація та стабілізація кінцевого продукту Після очищення рідину нейтралізують до оптимального pH, якщо це необхідно для стабілізації гіберелінової кислоти. Це може бути досягнуто шляхом додавання розчинів лугів або кислот, таких як NaOH або HCl. Після нейтралізації проводять стабілізацію розчину, щоб запобігти руйнуванню гіберелінової кислоти під час подальшого зберігання та транспортування. Для цього можуть бути використані стабілізатори або консерванти. Упаковка та зберігання Після завершення очищення та стабілізації гіберелінову кислоту упаковують у стерильні контейнери або флакони для подальшого використання в сільському господарстві або фармацевтичній промисловості. Продукт зберігається при температурі 4–8°C для збереження його активності протягом тривалого періоду. РОЗДІЛ 5. КОНТРОЛЬ ВИРОБНИЦТВА 5.1 Мікробіологічний контроль Мікробіологічний контроль є одним із важливих етапів у технології біосинтезу гіберелінової кислоти, оскільки забезпечує чистоту культури, її життєздатність та ефективність на всіх етапах культивування мікроорганізмів. Для контролю використовуються різноманітні методи, зокрема мікроскопія, а також більш спеціалізовані методи для оцінки активності та біосинтетичних можливостей культури Fusarium fujikuroi S109 [17, с. 1]. Одним із перших етапів мікробіологічного контролю є мікроскопічне спостереження за морфологічними ознаками клітин Fusarium fujikuroi S109. Це дозволяє визначити їх стан, форму та наявність спір, що є важливими показниками життєздатності культури. Всі забруднення чи аномалії можуть свідчити про можливі порушення в процесі культивування або контамінацію іншими мікроорганізмами [16, с. 203]. Основні параметри, що оцінюються при мікроскопії: Форма клітин: клітини гриба мають характерну форму міцелію, який зазвичай являє собою тонкі нитки. Для Fusarium fujikuroi це повинні бути гіллясті нитки, які на кінцях утворюють спори. Колір: зазвичай культура гриба має білувато-сірий або кремовий колір міцелію, який може змінюватися при зростанні колонії. Наявність спор: під час мікроскопії особливу увагу звертають на наявність спор на кінцях ниток міцелію. Наявність спор є підтвердженням того, що культура перебуває в активній фазі розвитку та здатна до репродукції. Чистота культури: для уникнення контамінації іншими мікроорганізмами проводиться перевірка на наявність бактерій чи інших грибів. Якщо виявлені чужорідні організми, культура не відповідає вимогам і повинна бути відкинута для подальшого використання. Під час цієї стадії можуть бути використані різні типи мікроскопії: яскравопольна мікроскопія для вивчення загальної структури клітин; флуоресцентна мікроскопія для виділення певних структур клітин, якщо використовуються специфічні барвники. Контроль чистоти культури Одним із важливих етапів мікробіологічного контролю є підтримання чистоти культури. Після того як культура вирощена на поживному середовищі, проводиться перевірка на наявність сторонніх мікроорганізмів, що можуть знижувати ефективність біосинтезу гіберелінової кислоти. Для цього проводяться такі операції: пересіви на нове середовище: з культур, які почали зростати на агаризованому середовищі, робляться пересіви на нові чашки Петрі, щоб відокремити колонії мікроорганізмів, що можуть бути заражені іншими мікроорганізмами; аналіз на контамінацію: для визначення наявності бактеріальної чи іншої контамінації проводиться забір проб з різних частин культури, включаючи поверхневі і глибші шари міцелію. Якщо культура не чиста, на наступних етапах можливі проблеми з біосинтезом. Для оцінки життєздатності культури в ході культивування проводиться кілька додаткових тестів, таких як: - оцінка росту міцелію на агаризованому середовищі чи в рідкому середовищі, що дозволяє визначити активність культури в процесі біосинтезу; - визначення здатності культури до зростання на новому середовищі або її реакція на зміни температури та pH. Якщо культура не реагує на ці зміни, це може бути показником її слабкої життєздатності. Перевірка на здатність до біосинтезу На цьому етапі здійснюється перевірка здатності культури Fusarium fujikuroi S109 до біосинтезу гіберелінової кислоти, що перевіряється через кілька методів: вимірювання концентрації гіберелінової кислоти в культуральній рідині за допомогою хроматографічних методів (HPLC або GC); оцінка змін у вигляді кольору середовища, що може бути пов’язано з біосинтезом певних продуктів. Зміни в кольорі культуральної рідини можуть бути індикаторами утворення гіберелінової кислоти або її попередників, які змінюють фізико-хімічні властивості середовища. 5.2 Показники росту і синтезу цільового продукту Для забезпечення високої ефективності біосинтезу гіберелінової кислоти важливо контролювати кілька ключових показників, які відображають активність культури Fusarium fujikuroi S109 і рівень синтезу цільового продукту. Одним з основних показників є концентрація біомаси, яка визначається за допомогою методу сухого зважування. Після фільтрації культуральної рідини від біомаси, осад сушать при температурі 105°C до постійної ваги, і потім вимірюється її маса, що дозволяє оцінити ріст культури, оскільки висока концентрація біомаси є ознакою активного росту міцелію. У процесі культивування концентрація біомаси може досягати 3–6 г/л, що є нормою для цього виду гриба. Ще одним важливим показником є концентрація гіберелінової кислоти в культуральній рідині. Для її визначення використовуються хроматографічні методи, зокрема високоефективна рідинна хроматографія (HPLC). Після того, як біомасу відокремлюють від рідкої фази, з супернатанту екстрагується гіберелінова кислота, яка потім підлягає хроматографічному аналізу. Норма концентрації гіберелінової кислоти може коливатися в межах 200–500 мкг/л після 72 годин культивування [18, с. 388]. Визначення концентрації джерел вуглецю та азоту в середовищі також є важливим для оцінки ефективності біосинтезу. Вуглецеві джерела, такі як глюкоза та етанол, повинні бути на рівні 40–60 г/л на початку культивування, оскільки це оптимальна концентрація для активного росту міцелію. Азотні джерела, такі як сечовина або амонійний азот, також мають бути присутніми в певних концентраціях, зазвичай 1–3 г/л, щоб забезпечити нормальний процес синтезу гіберелінової кислоти [19, с. 399]. Крім того, важливо контролювати рівень pH середовища, оскільки pH значно впливає на ріст культури і біосинтез цільового продукту. Оптимальний рівень pH для культивування Fusarium fujikuroi S109 становить 5,5. Відхилення від цього значення може призвести до зниження ефективності росту культури і синтезу гіберелінової кислоти, тому рівень pH регулярно контролюється і коригується [20, с. 399]. Швидкість аерації та перемішування також є критичними факторами для забезпечення оптимальних умов для мікроорганізмів. Для культури Fusarium fujikuroi S109 швидкість аерації повинна бути в межах 0,5–1,0 L/мін/л середовища, оскільки це дозволяє забезпечити достатню кількість кисню для мікроорганізмів, не викликаючи надмірної аерації. У процесі культивування швидкість перемішування не повинна перевищувати 100 об/хв, щоб уникнути надмірних зрізових зусиль, що можуть негативно вплинути на міцелій [21, с. 207]. Час культивування є ще одним важливим показником, оскільки він впливає на кількість синтезованого гібереліну. Оптимальна тривалість культивування для Fusarium fujikuroi S109 на середовищі з високою концентрацією джерел вуглецю і азоту становить 72-96 годин. Протягом цього часу культура досягає максимального рівня продуктивності, після чого активність біосинтезу починає знижуватися. 5.2.1 Концентрація біомаси Концентрація біомаси є одним з основних показників ефективності культивування Fusarium fujikuroi S109 та активності процесу біосинтезу гіберелінової кислоти. Біомаса є основною частиною культури, яка відповідає за виробництво цільового продукту, тому її концентрація в культуральній рідині дозволяє судити про продуктивність та стан культури. Визначення концентрації біомаси здійснюється за допомогою кількох методів, які дозволяють оцінити кількість мікроорганізмів, що виросли в процесі культивування. Одним із найбільш поширених методів є метод сухого зважування. В цьому випадку культуральну рідину фільтрують через спеціальний фільтр для відокремлення біомаси від супернатанту. Потім осад, що містить біомасу, сушать в сушильній шафі при температурі 105°C до досягнення постійної маси. Після цього зважують масу осаду, що дозволяє визначити концентрацію біомаси в культуральній рідині, що виражається в грамах на літр (г/л). Це дає змогу визначити рівень активності культури та її здатність до росту в певних умовах [18, с. 388]. Іншим методом визначення біомаси є метод флуоресцентної мікроскопії, при якому зразки культури забарвлюються специфічними флуоресцентними барвниками, що дозволяють під мікроскопом точно визначити кількість живих клітин мікроорганізмів. Цей метод є швидким і дозволяє отримати результат без необхідності фільтрації та сушіння [19, с. 399]. Концентрація біомаси є важливим показником на різних етапах культивування. На початкових етапах, коли культура тільки починає рости, концентрація біомаси може бути низькою (менше 1 г/л), але з часом, при оптимальних умовах, її кількість значно збільшується. На пізніших стадіях культивування біомаса може досягати 2–6 г/л, що є нормою для активного росту гриба Fusarium fujikuroi S109 [21, с. 207]. Також важливо зазначити, що концентрація біомаси може коливатися залежно від складу поживного середовища, параметрів аерації, температури та pH. Наприклад, для досягнення високої концентрації біомаси важливо підтримувати оптимальний рівень вуглецевих та азотних джерел у середовищі, оскільки вони є основними елементами для синтезу білків і інших клітинних компонентів. Крім того, підтримка стабільного pH та регулярна аерація можуть сприяти прискореному росту культури, що призводить до збільшення концентрації біомаси [20, с. 399]. Для більш точного моніторингу концентрації біомаси в реальному часі можна використовувати оптичні методи, такі як оптичні датчики густини в культуральній рідині. Ці датчики дозволяють визначити зміну густини рідини, що є пропорційним зміні концентрації біомаси [17, с. 1]. Загалом, визначення концентрації біомаси є важливим інструментом для контролю за ходом культивування Fusarium fujikuroi S109 та забезпеченням високої продуктивності біосинтезу гіберелінової кислоти. Зважаючи на важливість цього показника, регулярне вимірювання біомаси допомагає оперативно коригувати умови культивування для досягнення максимальних результатів у процесі виробництва. 5.2.2 Концентрація цільового продукту Концентрація гіберелінової кислоти, як основного цільового продукту в процесі культивування Fusarium fujikuroi S109, є одним із найважливіших показників, який оцінюється для визначення ефективності біосинтетичного процесу. Цей показник дозволяє судити про продуктивність мікроорганізмів і ефективність обраних умов культивування. Для отримання точних і достовірних результатів необхідно застосовувати методи, які забезпечують високий рівень точності при вимірюванні концентрації гіберелінової кислоти в культуральній рідині. Одним із основних методів визначення концентрації гіберелінової кислоти є високоефективна рідинна хроматографія (HPLC). Цей метод є золотим стандартом для вимірювання концентрацій органічних сполук, таких як фітогормони. Після відділення біомаси від культуральної рідини через фільтрацію, цільовий продукт екстрагується з рідкої фази за допомогою органічних розчинників, таких як метанол або етанол. Потім екстракт подається на хроматографічну колонку, де за допомогою розділення по різних властивостях (наприклад, полярності) визначають концентрацію гіберелінової кислоти в зразку [18, с. 388]. Розділення на хроматографічній колонці дозволяє точно виміряти пік, який відповідає гібереліновій кислоті. Порівнюючи отриману криву з калібрувальними стандартами, можна визначити точну кількість цільового продукту в культуральній рідині. Це дозволяє відслідковувати динаміку синтезу гіберелінової кислоти протягом процесу культивування, а також коригувати умови культивування для досягнення максимальної продуктивності [19, с. 399]. У більшості випадків концентрація гіберелінової кислоти вимірюється після 72–96 годин культивування. У цей період культура досягає максимального рівня продуктивності. Концентрація гіберелінової кислоти в культуральній рідині на пік синтезу може коливатися від 200 до 500 мкг/л в залежності від таких факторів, як склад поживного середовища, температура, pH, аерація та періодичність підживлення [20, с. 399]. Для того, щоб підвищити точність аналізу, можна також використовувати метод газорідинної хроматографії (GC), що є менш поширеним для вимірювання гіберелінової кислоти, але також дає точні результати, зокрема для аналізу неводорозчинних фітогормонів. Цей метод дозволяє розділяти та вимірювати леткі органічні сполуки, що може бути корисним для аналізу продуктів метаболізму, які супроводжують синтез гіберелінової кислоти [21, с. 207]. Концентрація гіберелінової кислоти залежить не лише від умов культивування, а й від типу середовища, що використовується для росту гриба. Наприклад, на середовищі з високою концентрацією глюкози та азоту рівень синтезу гіберелінової кислоти буде вищим порівняно з середовищем, де використовуються більш обмежені джерела вуглецю та азоту. Крім того, для підвищення концентрації гіберелінової кислоти можна застосовувати технології, які включають додавання підживлювальних розчинів або змінюють параметри аерації [18, с. 388]. Завдяки точним методам визначення концентрації гіберелінової кислоти, такі як HPLC, стає можливим не лише відстежувати продуктивність процесу біосинтезу, а й оптимізувати умови культивування для досягнення максимальної концентрації цільового продукту. Це дозволяє гарантувати стабільність та ефективність виробництва гіберелінової кислоти в промислових масштабах. 5.2.3 Концентрація джерела Карбону і Нітрогену Концентрація джерел вуглецю (карбону) і азоту (нітогену) у середовищі культивування є важливими факторами, що визначають ефективність росту Fusarium fujikuroi S109 і синтезу гіберелінової кислоти. Обидва ці елементи є основними для синтезу клітинних компонентів, білків, нуклеїнових кислот і інших метаболітів, необхідних для життєдіяльності мікроорганізму. Тому коригування концентрацій цих джерел є ключовим для досягнення оптимальних результатів біосинтезу. Джерела вуглецю, такі як глюкоза, етанол та інші органічні сполуки, є основними енергетичними джерелами для гриба Fusarium fujikuroi S109. Вуглецеві джерела використовуються для утворення клітинної маси, а також для метаболічних процесів, що забезпечують синтез цільового продукту — гіберелінової кислоти [19, с. 399]. Глюкоза є одним із найбільш використовуваних джерел вуглецю в культивувальних середовищах. Вона швидко засвоюється мікроорганізмами і сприяє активному росту міцелію, що необхідно для досягнення високої концентрації біомаси. Оптимальна концентрація глюкози в середовищі для культивування Fusarium fujikuroi S109 зазвичай становить від 30 до 60 г/л. Занадто висока концентрація глюкози може призвести до явища катаболітної репресії, де мікроорганізм знижує активність біосинтезу і починає метаболізувати вуглець на інші потреби, не сприяючи синтезу гіберелінової кислоти [18, с. 388]. Для підвищення продуктивності біосинтезу в окремих випадках можна додавати етанол. Враховуючи, що Fusarium fujikuroi S109 добре використовує етанол як джерело вуглецю, його концентрація в середовищі може варіювати від 10 до 20 г/л. Етанол також сприяє росту грибів при деяких умовах, але його концентрація не повинна бути надмірною, оскільки це може негативно вплинути на життєздатність культури [20, с. 399]. Нітроген є основним елементом, що входить до складу амінокислот, білків і нуклеїнових кислот. Для росту Fusarium fujikuroi S109 необхідні джерела азоту, такі як сечовина, амонійні солі (наприклад, амоній сульфат) або нітрати. У середовищі для культивування цього гриба зазвичай використовують сечовину як основне джерело азоту. Оптимальна концентрація сечовини в середовищі повинна становити 1–3 г/л, оскільки вона забезпечує достатню кількість азоту для синтезу білків і клітинних компонентів [21, с. 207]. Важливо зазначити, що занадто висока концентрація сечовини може призвести до токсичності і пригнічення росту культури. Водночас недостатня кількість азоту обмежить зростання і біосинтез. Вибір оптимальної концентрації азоту в середовищі має важливе значення для підтримання балансу між ростом міцелію і синтезом гіберелінової кислоти [19, с. 399]. Крім сечовини, можна використовувати інші джерела азоту, такі як амоній сульфат або амоній фосфат. Для підвищення ефективності біосинтезу часто використовують комбінацію різних джерел азоту. Наприклад, суміш сечовини та амоній сульфату дозволяє підтримувати стабільну концентрацію азоту, що сприяє як росту клітин, так і продукції гіберелінової кислоти [20, с. 399]. Баланс між джерелами вуглецю та азоту в середовищі має важливе значення для біосинтезу. Співвідношення вуглець/азот (C/N) повинно бути оптимальним для підтримки росту культури і виробництва гіберелінової кислоти. Для Fusarium fujikuroi S109 оптимальне співвідношення C/N зазвичай складає 20:1 до 30:1. Це означає, що в середовищі має бути достатньо вуглецю для забезпечення енергії для росту міцелію, а також достатня кількість азоту для синтезу білків і нуклеїнових кислот [21, с. 207]. Низьке співвідношення вуглець/азот може призвести до дефіциту енергії для росту гриба, що впливатиме на синтез гіберелінової кислоти. З іншого боку, надлишок азоту може затримати ріст і призвести до зниження ефективності біосинтезу. Тому важливо підтримувати баланс між цими елементами на всіх етапах культивування [18, с. 388]. Концентрація джерел вуглецю і азоту може бути визначена за допомогою таких методів, як колориметрія або титрування. Колориметричні методи дозволяють визначати концентрацію глюкози, сечовини та інших компонентів у середовищі. Також можливе використання методу амонієвого іонного тесту для визначення рівня амонійних солей в середовищі [19, с. 399]. За допомогою цих методів можна контролювати рівень джерел вуглецю і азоту в реальному часі та коригувати їх концентрацію для оптимізації умов культивування та біосинтезу гіберелінової кислоти. ЛІТЕРАТУРА Лучкiв О.М., Кобилецька М.С., Терек О.I. Вмiст низькомолекулярних компонентiв антиоксидантної системи у проростках кукурудзи i пшеницi за дiї салiцилату й iнфiкування Fusarium graminearum Schwabe. Вісник Харківського національного аграрного університету, 2013. С. 38–45. Парфенюк А.І, Безноско І.В. Інтенсивність спороутворення фітопатогенних грибів на сортах та гібридах перцю солодкого. Вісник Харківського національного аграрного університету, 2012. Вип. 3 (27). С. 104–108. Фуртат І.М., Остапюк Н.А., Антонюк М.З. Біологічні особливості та екологія представників роду Fusarium, збудників захворювань злаків. Наукові записки НаУКМА. Природничі науки. 2017. Т. 197. С. 2–18. Фуртат І.М., Остапюк Н.А., Жукова К.О. Видовий склад і біологічні особливості представників роду Fusarium, виділених із зерна Triticumaestivum L. Наукові записки НаУКМА. Біологія і екологія, 2018. С. 1–7. Alisaac E., MahleinA.-K.Fusarium Head Blight on Wheat: Biology, Modern Detection and Diagnosis and Integrated Disease Management. Toxins. 2023. V. 15 (3). P. 1–23. Antonissen G., Martel A., Pasmans F., Ducatelle R. The impact of Fusarium mycotoxins on human and animal host susceptibility to infectious diseases. Toxins. 2014. V. 6 (2). P. 430–452 Baumgardt M., Grudzinska-Sterno M., Djurle A. Mycotoxin producing Fusarium species in oats during the growing season. Cereal Research Communications. 2008. V. 36. P. 473–475. Beev G., Denev S., Pavlov D. Occurrence and distribution of Fusarium species in wheat grain. Agricultural science and technology. 2011. V. 3 (2). P. 165–168. Booth C. The genus Fusarium. Wallingford, UK: C.A.B. International, 1971. 237 р. Brizuela A.M., Lalak-Kańczugowska J., Koczyk G., Stepien Ł. Geographical Origin Does Not Modulate Pathogenicity or Response to Climatic Variables of Fusarium oxysporum Associated with Vascular Wilt on Asparagus. J. Fungi. 2021. – V. 7 (12). P. 1–14 Brown D.W., Butchko R.A., Busman M., Proctor R.H. Identification of gene clusters associated with fusaric acid, fusarin, and perithecial pigment production in Fusarium verticillioides. Fungal Genet. Biol. 2012. V. 49 (7). P. 521–532 Ferrigo D., Raiola A., Causin R. Fusarium Toxins in Cereals: Occurrence, Legislation, Their Management. Molecules. DOI: 10.3390/molecules21050627 Gabiatti C., Vendruscolo F., Piaia J.C.Z., Rodrigues R.C., Durrant L.R., Costa J.A.V. Radial growth rate as a tool for the selection of filamentous fungi for use in bioremediation. Brazilian Arch Biol Technol. 2006. Р. 29–34. Glantz S.A. The special case of two groups: The t Test. In: Primer of Biostatistics. 7th ed. The McGraw-Hill Companies; 2012, Р. 49–72. Imathiu S.I., Edwards S.G., Ray R.V., Back M.A. Fusarium langsethiae – a HT-2 and T-2 Toxins Producer that Needs More Attention. J. Phytopathol. 2013. V. 161. Р. 1–10. Kurt B., Farnleitner A., Mach R.L. Novel Methods for the Quantification of Pathogenic Fungi in Crop Plants: Quantitative PCR and ELISA Accurately Determine Fusarium Biomass. Plant Pathology. InTech, 2012. P. 203– 218. Leslie J.F., Summerell B.A. Fusarium: genomics, molecular and cellular biology.Norfolk, UK: Caister Academic Press; 2013. Chapter 1, An Overview of Fusarium. Р. 1–10. Leslie J.F., Summerell B.A. The Fusarium Laboratory Manual. First edit. Iowa, USA: Blackwell Publishing; 2006. 388 p. Ma L.-J., Geiser D.M., Proctor R.H., Rooney A.P. Fusarium pathogenomics. Annu Rev Microbiol. 2013. V. 67. P. 399–416. Ma L-J., Geiser D.M., Proctor R.H., Rooney A.P., O’Donnell K., Trail F., et al. Fusarium Pathogenomics. Annu Rev Microbiol. 2013. Р. 399–416. Parry D.W., Jenkinson P., McLeod L. Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals – a review. Plant Pathol. 1995. V. 44 (2). P. 207–238. Stępień Ł. Plant-Pathogenic Fusarium species. J. Fungi. 2023. V. 9 (1). P. 1–3. Summerell B.A., Sallen B., Leslie J.F. Utilitarian Approach to Fusarium Identification. Plant Dis. 2023. V. 87 (2). P. 117–128. Witaszak N., Lalak-Kańczugowska J., Waśkiewicz A., Stępień Ł. The Impacts of Asparagus Extract Fractions on Growth and Fumonisins Biosynthesis in Fusarium Proliferatum. Toxins. 2020. V. 12 (2). P. 95–109. Zhang X.-X., Sun H.-Y., Shen C.-M., Li W. Survey of Fusarium spp. causing wheat crown rot in major winter wheat growing regions of China. Plant Dis. 2015. V. 99 (11). P. 1610–1615 ДОДАТКИ Додаток А https://prom.ua/ua/p1646750508-otrubi-pshenichnye-1kg.html https://rozetka.com.ua/ua/479927134/p479927134 https://prom.ua/ua/p2557977839-karbamid-mochevina.html https://bigl.ua/ua/p988374814-maslo-lna-litr?utm_source=pmax&utm_medium=cpa&utm_content=ua&utm_campaign=top_sell_ua&gad_source=1&gad_campaignid=21285772073&gclid=CjwKCAjwtrXFBhBiEiwAEKen16i8-jlX6dr6Tupass4CbhzxBPoyRkTn8YDr5CCf92K7JhhCWPzWHxoCHZ4QAvD_BwE https://prom.ua/ua/p2197997216-sulfat-magniyu1kg-rozdrib.html https://mychem.in.ua/ua/p1830467432-sulfat-tsinka-vodnyj.html?srsltid=AfmBOoqysNhHjWEdnY6vb-Lx0d3err9KwXD1bevE-la6wgB6AiNaYerD https://mychem.in.ua/ua/p2243777038-mednyj-kuporos-sulfat.html?srsltid=AfmBOoo2XY7N5bCtsQQj0oXX65WwqWJrIrUX0wgJ2yh7wozKc5KF_M2c https://prom.ua/ua/p1090561770-zhelezo-sernokisloe-vodnoe.html https://prom.ua/ua/p2580455546-sernaya-kislota.html?utm_source=google_product&utm_medium=cpc&utm_content=pla&utm_campaign=KT_cpc_1_5297199152&gad_source=1&gad_campaignid=20983226771&gclid=CjwKCAjwtrXFBhBiEiwAEKen16I4xgCcM9CXXQ-f66gOwmLkchxrsO01YkxEFNcEhkNzPP_QCaV6NBoCqx0QAvD_BwE https://rozetka.com.ua/ua/vira-vi0511/p390675594 https://prom.ua/ua/p1268969849-kukuruznaya-muka.html https://prom.ua/ua/p1646750074-risovaya-muka-1kg.html https://prom.ua/ua/p2430252207-soevyj-zhmyh-1kg.html https://prom.ua/ua/p2677914089-arahisovaya-muka.html https://prom.ua/ua/p1091383043-kalij-fosfornokislyj-zameschennyj.html https://prom.ua/ua/p1895665506-sulfat-kaliya-1kg.html https://mychem.in.ua/ua/p2088566151-magnij-sulfat-vodnyj.html?srsltid=AfmBOoqBGIDs3MGcuJdUSg5FLTMR5KCR2jrn7q3mvp1G0x1HUmpTqvJ_ https://prom.ua/ua/p1148974902-glitserin.html https://novus.zakaz.ua/ru/products/frukt-tsitrus--novus02858684000000 https://prom.ua/ua/p1090613978-natrij-azotnokislyj-nitrat.html?utm_source=google_product&utm_medium=cpc&utm_content=pla&utm_campaign=KT_cpc_1_5297199152&gad_source=1&gad_campaignid=20983226771&gclid=CjwKCAjwtrXFBhBiEiwAEKen1zGXh68GxdLCfnwm3wAmp-9lisKQ6-HLZC7A3N06gNmmeMA4AUcwLBoCkw8QAvD_BwE https://prom.ua/ua/p1091383043-kalij-fosfornokislyj-zameschennyj.html https://mychem.in.ua/ua/p2243777038-mednyj-kuporos-sulfat.html?srsltid=AfmBOoo2XY7N5bCtsQQj0oXX65WwqWJrIrUX0wgJ2yh7wozKc5KF_M2c https://mychem.in.ua/ua/p2088566151-magnij-sulfat-vodnyj.html?srsltid=AfmBOoqBGIDs3MGcuJdUSg5FLTMR5KCR2jrn7q3mvp1G0x1HUmpTqvJ_ https://prom.ua/ua/p1090607359-kalij-hloristyj-hlorid.html?utm_source=google_product&utm_medium=cpc&utm_content=pla&utm_campaign=KT_cpc_1_5297199152&gad_source=1&gad_campaignid=20983226771&gclid=CjwKCAjwtrXFBhBiEiwAEKen15_bopCfsj6TP9V1JbjLw2odNGbCJT6VVmptBn8w45afNBTJSMlFxBoCr-EQAvD_BwE https://prom.ua/ua/p1090561770-zhelezo-sernokisloe-vodnoe.html Додаток Б Додаток В Технологічна схема