МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології і мікробіології КУРСОВА РОБОТА з дисципліни «Нормативне забезпечення біотехнологічних виробництв» на тему: «Біосинтез сизоміцину Micromonospora inyoensis» м. Київ - 2025 рік РЕФЕРАТ Курсова робота присвячена вивченню біосинтезу сизоміцину за допомогою штаму Micromonospora inyoensis. Робота охоплює аналіз і вибір оптимальних умов для культивування цього штаму, а також розробку технологічної схеми для отримання сизоміцину як біологічного антибіотика. На основі порівняльного аналізу різних потенційних штамів було обрано Micromonospora inyoensis, який характеризується високою ефективністю у виробництві сизоміцину. Зокрема, цей штам демонструє високу продуктивність при синтезі антибіотика, що робить його перспективним для промислового застосування. Технологічна схема біосинтезу включає кілька етапів, таких як підготовка поживних середовищ, стерилізація, вирощування посівного матеріалу та культивування у ферментері. Ферментер об'ємом 1 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,5 використовуватиметься для біосинтезу сизоміцину. Крім того, розглянуто контроль за виробництвом, включаючи мікробіологічний контроль, а також вимірювання концентрацій біомаси та цільового продукту. Курсова робота складається з вступу, п'яти розділів, списку використаних джерел та технологічної схеми (формат А3). Загальний обсяг роботи – ... сторінок, 1 рисунок, 11 таблиць. Ключові слова: сизоміцин, Micromonospora inyoensis, біосинтез, ферментер, поживне середовище, мікробіологічний контроль. ЗМІСТ ВСТУП Актуальність теми біосинтезу антибіотиків є надзвичайно важливою в контексті розвитку біотехнологічних процесів, спрямованих на отримання нових, ефективних лікарських засобів для боротьби з бактеріальними інфекціями. Сизоміцин — один з перспективних антибіотиків, який належить до класу аміноглікозидів. Він має високі антимікробні властивості, ефективно борючись з різними бактеріальними інфекціями, зокрема, резистентними до інших класів антибіотиків. Тому дослідження процесу його біосинтезу має важливе значення для фармацевтичної промисловості. Micromonospora inyoensis є одним із біологічних агентів, що здатен синтезувати сизоміцин. Цей штам, за результатами численних досліджень, продемонстрував високу ефективність у виробництві цього антибіотика при певних умовах культивування. Однак на даний час існують певні проблеми, пов’язані з оптимізацією умов його культивування та вдосконаленням технології біосинтезу, що потребує подальших досліджень. У зв'язку з цим, актуальним є вивчення біосинтезу сизоміцину за допомогою штаму Micromonospora inyoensis. Вивчення його властивостей та розробка технологічної схеми для отримання сизоміцину є важливим кроком до підвищення ефективності промислового виробництва антибіотиків. Зокрема, однією з основних задач є оптимізація складу поживних середовищ та умов культивування, що забезпечить високу продуктивність синтезу. Новизна роботи полягає в дослідженні процесу біосинтезу сизоміцину із застосуванням штаму Micromonospora inyoensis, аналізі оптимальних умов культивування, а також у розробці технологічної схеми для його виробництва. РОЗДІЛ 1. ОПИС ЦІЛЬОВОГО ПРОДУКТУ Сизоміцин — це біологічно активна речовина, що є антибіотиком, який виробляється штамом Micromonospora inyoensis. Препарат має хімічну формулу C21H42N2O12. Температура плавлення сизоміцину становить 215–220°C, а температура розкладання — 540°C. Він розчиняється у воді та метанолі, але майже не розчиняється в етанолі та ацетоні. В ультрафіолетовому спектрі сизоміцин поглинає світло при максимальній довжині хвилі 290 нм [4, с. 98]. Сизоміцин має високу антимікробну активність, зокрема проти грампозитивних і грамнегативних бактерій, включаючи резистентні до інших антибіотиків штами. Механізм його біологічної дії полягає в інгібуванні синтезу білка в бактеріальних клітинах, що призводить до їх загибелі. Препарат активно діє на бактерії, порушуючи процеси їх метаболізму і розмноження [3, с. 115]. Фармакокінетика сизоміцину включає швидку абсорбцію після введення, досягаючи максимальних концентрацій у крові протягом 1–2 годин. Препарат рівномірно розподіляється в організмі, активно проникаючи в тканини, уражені інфекцією. Метаболізується він у печінці, утворюючи неактивні метаболіти, і виводиться через нирки, в основному в незміненому вигляді [15, с. 480]. З точки зору фармакодинаміки, сизоміцин має бактеріоцидну дію, що забезпечує швидке знищення бактерій при високих концентраціях. Його застосовують для лікування інфекцій, викликаних бактеріями, стійкими до інших антибіотиків, таких як Pseudomonas aeruginosa і Staphylococcus aureus. Він також ефективний для лікування різноманітних бактеріальних інфекцій у медичній практиці, включаючи урологічні, пульмонологічні, хірургічні та гінекологічні захворювання. Окрім того, сизоміцин використовується в ветеринарії для лікування інфекцій у тварин [3, с. 119]. Органолептичні показники. Сизоміцин — це безбарвний або світло-жовтий порошок, який має характерний запах, що властивий для антибіотиків аміноглікозидної групи. Препарат має гіркий смак при розчиненні у воді, що є типовим для багатьох антибіотиків, і є малорозчинним у спирті та ацетоні [11, с. 9]. Хімічні властивості. Сизоміцин є антибіотиком, що належить до аміноглікозидів, зі складною хімічною структурою, що включає циклогексанове кільце. Молекулярна маса становить 522,6 г/моль. Препарат стабільний при зберіганні в сухому вигляді, але під час тривалого контакту з водою може частково втрачати свою активність через гідроліз [11, с. 9]. Хімічний синтез. Сизоміцин виробляється за допомогою мікробіологічного синтезу з використанням штаму Micromonospora inyoensis, що є природним продуцентом цієї речовини. Процес включає вирощування мікроорганізмів на спеціально підібраних поживних середовищах при оптимальних умовах температури та вологості. Для підвищення продуктивності процесу використовують методи модифікації середовища та ферментації [11, с. 8]. Сфери застосування. Сизоміцин використовується в медичній практиці для лікування інфекцій, викликаних чутливими бактеріями. Зокрема, він застосовується в урології для лікування інфекцій сечових шляхів, у пульмонології для лікування пневмонії та бронхітів, а також у хірургії для профілактики та лікування післяопераційних інфекцій. Крім того, препарат має застосування в ветеринарії для лікування бактеріальних інфекцій у тварин, зокрема при лікуванні інфекцій дихальних шляхів [11, с. 10]. Зважаючи на вищезазначене, сизоміцин є актуальним і перспективним препаратом для промислового виробництва антибіотиків. РОЗДІЛ 2. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ БІОЛОГІЧНОГО АГЕНТА, СКЛАДУ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ 2.1 Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування У виборі біологічного агента для синтезу сизоміцину важливим фактором є здатність мікроорганізмів до високопродуктивного синтезу бажаного продукту за оптимальних умов культивування. Різні мікроорганізми можуть мати різні переваги та недоліки в залежності від їх здатності до синтезу антибіотика, стійкості до контамінацій, швидкості росту та здатності використовувати дешевші поживні середовища. Однак не всі мікроорганізми підходять для промислового виробництва антибіотиків через обмежену продуктивність, складність технологічного процесу або потребу у складних поживних середовищах. Для виробництва сизоміцину було обрано штам Micromonospora inyoensis, оскільки він демонструє високу ефективність у синтезі антибіотика при порівняно простих умовах культивування. Цей штам має кілька переваг: високу продуктивність, здатність до синтезу на простих поживних середовищах, стійкість до контамінації та відносно коротку тривалість процесу культивування. Крім того, Micromonospora inyoensis має високу швидкість росту, що дозволяє забезпечити великий обсяг виробництва антибіотика за мінімальний час. Для культивування штаму Micromonospora inyoensis використовуються поживні середовища, що містять основні компоненти для росту мікроорганізмів, такі як вуглець, азот, фосфор та мікроелементи. Зокрема, як джерела вуглецю використовуються глюкоза або крохмаль, а для забезпечення необхідного рівня азоту використовуються амонійні солі. Склад поживного середовища оптимізовано для досягнення максимального синтезу сизоміцину при помірних витратах на компоненти. Табл. 2.1 відображає дані щодо кількох відомих біологічних агентів, що використовуються для виробництва різних біологічно активних речовин, зокрема антибіотиків. Аналіз табл. 2.1 показує, що серед відомих біологічних агентів, що використовуються для синтезу поверхнево-активних речовин, штам Micromonospora inyoensis має високу ефективність при порівняно простих умовах культивування, що дозволяє досягти оптимальних результатів при синтезі сизоміцину, що робить цей штам перспективним для промислового використання. У порівнянні з іншими агентами, такими як Micromonospora inyoensis і Penicillium chrysogenum, Micromonospora inyoensis має швидший ріст та здатність до синтезу на простих поживних середовищах, що знижує витрати на виробництво. Також важливим є відсутність необхідності у складних процесах контролю, таких як регуляція рН або двостадійне культивування, що характерно для деяких інших штамів. На наступному етапі, на основі даних, наведених у табл. 2.1, було проведено розрахунок вартості поживних середовищ, використовуваних для вирощування біологічних агентів, що синтезують поверхнево-активні речовини. Враховуючи концентрацію компонентів у поживному середовищі, а також ціни на ці компоненти, ми визначили вартість кожного компонента для приготування 1 літра поживного середовища. Як видно з табл. 2.2, вартість компонентів різних поживних середовищ варіюється в залежності від типу біологічного агента. Для вирощування штаму Micromonospora inyoensis, який використовує глюкозу, амонійні солі та фосфатні солі, ціна на компоненти поживного середовища складає 1,45 грн на 1 л середовища. Для інших штамів, таких як Micromonospora inyoensis, Bacillus subtilis та Penicillium chrysogenum, ціна компонентів середовища також різна, але у більшості випадків вартість поживних середовищ знаходиться в межах 1,00–1,50 грн на 1 л. Для точності розрахунків у таблиці також вказано джерела інформації про ціни компонентів поживних середовищ, зокрема прайс-листи постачальників, що використовувались для отримання актуальних даних. У табл. 2.3 наведено розрахунки умовної вартості 1 г поверхнево-активних речовин для різних біологічних агентів. Дані, наведені у таблиці 2.3, засвідчують, що найбільш економічно вигідним для виробництва поверхнево-активних речовин є штам Micromonospora inyoensis. Він має найнижчу умовну вартість 1 г цільового продукту, що становить 26,32 грн/г, завдяки високій кількості синтезованої речовини за годину та меншій вартості поживного середовища. У порівнянні з іншими штамами, такими як Micromonospora inyoensis, Bacillus subtilis та Penicillium chrysogenum, цей штам має перевагу у вигляді низької вартості 1 г поверхнево-активної речовини, що робить його більш привабливим для промислового використання з економічної точки зору. Таблиця 2.1 Особливості одержання поверхнево-активних речовин на суміші ростових субстратів Таблиця 2.2 Вартість поживних середовищ для культивування продуцентів ПАР *Примітка: Ціни наведено за прайс-листом постачальника станом на 01.09.2025: 1 - http://prom.ua Таблиця 2.3 Умовна вартість 1 г поверхнево-активних речовин, синтезованих на суміші ростових субстратів На основі наведених у табл. 2.3 даних, найбільш ефективним біологічним агентом для біосинтезу поверхнево-активних речовин є Micromonospora inyoensis. Цей штам характеризується найбільшою кількістю утвореного продукту за годину та прийнятною умовною вартістю одиниці продукції, що робить його найбільш вигідним для промислового виробництва з точки зору економічної ефективності, оскільки він поєднує високу продуктивність і низькі витрати на виготовлення одиниці продукції. 2.2 Перевірочний розрахунок складу поживного середовища Перевірочний розрахунок складу поживного середовища є важливим етапом для визначення можливості ефективного біосинтезу цільового продукту обраним біологічним агентом. На основі вимог до складу поживних середовищ та хімічного складу мікробної клітини, а також показників біосинтезу процесу, здійснюваного Micromonospora inyoensis, був проведений розрахунок складу середовища для біосинтезу поверхнево-активних речовин. Відповідно до загальних вимог до складу поживних середовищ, для біосинтезу поверхнево-активних речовин штам Micromonospora inyoensis потребує джерел карбону та азоту у формі, доступній для мікроорганізмів. Враховуючи хімічний склад мікробної клітини, де карбон становить 50%, азот — 10-14%, а інші елементи (фосфор, сульфур, калій тощо) у меншій кількості, для забезпечення ефективного росту мікроорганізмів та синтезу продукту необхідно правильно збалансувати ці компоненти. При розрахунку складу поживного середовища для біосинтезу цільового продукту необхідно врахувати, що концентрація джерела карбону та азоту повинна бути оптимальною для максимального синтезу. Для штаму Micromonospora inyoensis рекомендовані концентрації цих компонентів в середовищі складають: Глюкоза (джерело карбону): 15 г/л Амонійні солі (джерело азоту): 5 г/л Завдяки таким концентраціям буде забезпечено стабільне зростання мікроорганізмів на стадії культивування та високий рівень біосинтезу поверхнево-активних речовин. Важливо, що для підготовки інокуляту концентрація цих компонентів може бути в два рази нижчою, ніж для середовища, яке використовується на етапі виробничого біосинтезу. Для перевірки правильності вибору складу поживного середовища, потрібно провести наступний розрахунок: в основі формули повинні бути використані дані про потреби штаму Micromonospora inyoensis щодо концентрації карбону та азоту, а також їх вплив на накопичення біомаси і синтез цільового продукту. При тривалості культивування 48 годин, концентрація лізину в культуральній рідині становить 0,5 г/л, а концентрація біомаси — 10 г/л. Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення Для синтезу лізину мікроорганізм потребує джерела вуглецю, яке в середовищі зазвичай представлено у вигляді глюкози. Згідно з хімічним складом мікробної клітини, вуглець становить близько 50% її маси. При концентрації лізину 0,5 г/л і враховуючи, що для синтезу лізину необхідно певне співвідношення між вуглецем і лізином, можна провести наступний розрахунок: для синтезу 1 г лізину потрібно близько 2,5 г вуглецю (враховуючи молекулярну масу і співвідношення вуглецю в лізині). Тому для отримання 0,5 г лізину потрібно 1,25 г вуглецю. Якщо концентрація глюкози в середовищі складає 20 г/л, то для забезпечення необхідної кількості вуглецю треба розрахувати, скільки глюкози потрібно для досягнення цієї кількості вуглецю. Молекулярна маса глюкози становить 180 г/моль, а кількість молекул вуглецю в 1 молекулі глюкози — 6, тому на 1 г глюкози припадає 0,033 моль вуглецю. Для забезпечення 1,25 г вуглецю потрібно 37,88 г глюкози. Розрахунок потреб для синтезу біомаси (джерело вуглецю) Для синтезу біомаси мікроорганізм також потребує джерела вуглецю. При концентрації біомаси 10 г/л і знаючи, що вуглець становить 50% маси біомаси, можна розрахувати, скільки вуглецю необхідно для синтезу 10 г біомаси. Для цього: 10 г біомаси * 0,5 = 5 г вуглецю. Це означає, що для синтезу 10 г біомаси потрібно 5 г вуглецю. Як ми бачили, для забезпечення 1,25 г вуглецю потрібна глюкоза в кількості 37,88 г, отже для 5 г вуглецю — 189,4 г глюкози. Це розрахунок для біомаси, де кількість вуглецю прямо пропорційна масі клітини. Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення Джерело азоту в поживному середовищі зазвичай представлено амонійними солями або іншими азотистими сполуками. Для синтезу біомаси та лізину необхідно визначити потребу в азоті. Азот в біомасі складає приблизно 10-14% від маси клітини. При концентрації біомаси 10 г/л, потреба в азоті складе: 10 г * 0,12 = 1,2 г азоту на 1 л середовища. Для синтезу лізину, зважаючи на те, що лізин містить близько 10-15% азоту, розрахунок потреби в азоті для синтезу 0,5 г лізину виглядає так: 0,5 г * 0,12 = 0,06 г азоту на 1 л середовища для лізину. Таким чином, для синтезу 10 г біомаси та 0,5 г лізину в сумі потрібно 1,26 г азоту на 1 л середовища. Розрахунок потреб для синтезу лізину (джерело азотного живлення) Для синтезу лізину, де азот становить 10-15% маси, можна розрахувати, скільки азоту потрібно для синтезу 0,5 г лізину. При цьому, оскільки лізин складається на 14% з азоту, на 0,5 г лізину необхідно: 0,5 г * 0,14 = 0,07 г азоту. Це необхідна кількість азоту для синтезу 0,5 г лізину в культуральній рідині. Розрахунок вмісту органічного азоту в середовищі Органічний азот у середовищі забезпечує основну потребу мікроорганізмів для синтезу біомаси та продукту. Для синтезу 10 г біомаси та 0,5 г лізину ми розраховуємо загальний вміст азоту, що становить 1,26 г. Органічний азот (азот з амонійних солей або амінокислот) в середовищі складає основну частину. Для забезпечення цього обсягу азоту використовується джерело азотистих сполук у вигляді амонійних солей, що містять приблизно 10-14% азоту. Розрахунок вмісту у середовищі джерел мінерального азоту Мінеральний азот у середовищі зазвичай представлений амонієм (NH₄⁺) або іншими солями. Для синтезу біомаси та лізину амонієві солі є основним джерелом азоту. Враховуючи потребу в 1,26 г азоту для синтезу 10 г біомаси та 0,5 г лізину, амонійні солі повинні бути введені у середовище у відповідних кількостях. Наприклад, для 1 г азоту необхідно 2,9 г амонійної солі, тому для потреб 1,26 г азоту потрібно 3,66 г амонійних солей на 1 л середовища. Розрахунок складу мелясно-сольового підживлювального розчину Мелясно-сольовий підживлювальний розчин часто використовується для забезпечення мікроорганізмів усіма необхідними макро- та мікроелементами для ефективного росту. Для розрахунку складу цього розчину на 1 літр середовища, можна використовувати наступні компоненти: мелясу як джерело вуглецю, а також мінеральні солі для забезпечення мікроелементами (азот, фосфор, калій, магній та інші). Зазвичай концентрація мелясу в розчині становить 20 г/л, а для забезпечення оптимальних умов для росту мікроорганізмів необхідно додавати 5 г/л амонійних солей та 3 г/л фосфатних солей, що дозволяє забезпечити необхідний вміст вуглецю та азоту, що є основними компонентами для росту мікроорганізмів і синтезу продукту. Вода використовується як розчинник, і її об'єм досягає 1 л. Розрахунок вмісту в середовищі Для ефективного синтезу лізину, вміст основних компонентів у середовищі має бути збалансованим. Для цього необхідно врахувати, що вуглець, як основний компонент живлення, має становити 50% від маси біомаси, а азот — близько 10-14%. Для синтезу 10 г біомаси та 0,5 г лізину необхідно 5 г вуглецю та 1,26 г азоту. Це означає, що у середовищі для 1 л повинно міститися 20 г глюкози, що дає 5 г вуглецю, а також амонійні солі у кількості 1,26 г азоту. Розрахунок потреби в інших елементах, таких як фосфор та сульфур, залежить від вимог до їх концентрації в клітинах мікроорганізмів, що зазвичай складають до 5% від загальної маси. Інші компоненти середовища До інших компонентів середовища для ефективного росту мікроорганізмів належать мінеральні солі, такі як калій, магній, кальцій та залізо. Зазвичай їх концентрація в середовищі становить 0,5-1% від загальної маси поживного середовища. Для підтримки осмотичного балансу та оптимальних умов для біосинтезу, калій необхідний у кількості 0,5 г/л, магній — 0,3 г/л, кальцій — 0,1 г/л, а залізо — 0,05 г/л, що дозволяє забезпечити нормальний ріст клітин і підтримувати їх біохімічні процеси. Розрахунок кількості компонента для нейтралізації культуральної рідини Для нейтралізації кислотності культуральної рідини, яка може виникнути внаслідок утворення органічних кислот під час біосинтезу, необхідно додавати лужний компонент, наприклад, натрію гідроксид (NaOH). Для нейтралізації 1 л культуральної рідини, в якому pH становить 4,5, необхідно додати 0,05 моль NaOH. Розрахунок кількості NaOH для нейтралізації полягає в наступному: 1 моль NaOH нейтралізує 1 моль кислот. Якщо для цього потрібно 0,05 моль NaOH, це означає, що потрібно 2 г NaOH (молекулярна маса NaOH — 40 г/моль). Отже, для нейтралізації 1 л культуральної рідини потрібно 2 г NaOH. У табл. 2.4 наводиться склад поживного середовища для культивування продуцента лізину, зокрема концентрації основних компонентів, таких як глюкоза та амонійні солі, які необхідні для росту мікроорганізмів і біосинтезу лізину. Також вказано вміст мінеральних солей, калію, магнію, кальцію та заліза, що забезпечують підтримку біохімічних процесів у клітинах. Для коригування pH культуральної рідини після утворення органічних кислот додається натрію гідроксид. Таблиця 2.4 Склад поживного середовища для культивування продуцента лізину Отже, перевірочний розрахунок складу поживного середовища для біосинтезу поверхнево-активних речовин, що здійснюється штамом Micromonospora inyoensis, показує, що оптимальні концентрації джерел карбону та азоту забезпечують високий рівень росту мікроорганізмів і ефективний синтез цільового продукту. Тому обране поживне середовище є придатним для використання на етапі виробничого біосинтезу. РОЗДІЛ 3. ОБҐРУНТУВАННЯ ВИБОРУ ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ 3.1 Вибір умов і способу культивування У виборі умов культивування для біосинтезу лізину з використанням штаму Micromonospora inyoensis важливим аспектом є забезпечення оптимальних параметрів для максимального росту мікроорганізмів та синтезу продукту. Ось ключові умови та способи культивування, які обґрунтовані на основі фізико-хімічних властивостей штаму та вимог до продукту. Аеробні чи анаеробні умови. Micromonospora inyoensis є аеробним мікроорганізмом, тому для ефективного біосинтезу лізину необхідно забезпечити достатнє постачання кисню. Це можна досягти за допомогою аерації під час культивування, що сприяє максимальному росту клітин та синтезу лізину. Анаеробні умови не підходять для цього штаму, оскільки вони негативно впливають на його здатність до біосинтезу. Асептичні чи неасептичні умови. Оскільки оптимальний pH для синтезу лізину знаходиться в межах 4,0–4,5, і штам Micromonospora inyoensis є термофільним, що дозволяє проводити культивування при температурі 45–55°C, процес може бути реалізований у нестерильних (неасептичних або умовно асептичних) умовах. Це дає змогу знизити витрати на стерилізацію та полегшити контроль за процесом без шкоди для результату. З підживленням чи без підживлення. Культивування з підживленням є оптимальним для синтезу лізину, оскільки цей продукт має високу концентрацію (50–150 г/л) в культуральній рідині, і для його біосинтезу необхідно забезпечити високі концентрації субстрату (глюкози) у процесі культивування. Спочатку в середовище додається 40–60 г/л глюкози, а решта порційно (дробне внесення субстрату) протягом культивування, щоб уникнути явища катаболітної репресії та підтримувати стабільний рівень росту. У випадку використання підживлення слід врахувати збільшення об'єму культуральної рідини, тому початковий коефіцієнт заповнення ферментатора має бути меншим, ніж на кінці процесу. Спосіб культивування (глибинне чи твердо-фазове). Для синтезу лізину найефективнішим є глибинне культивування в рідкому середовищі, оскільки цей процес забезпечує більш рівномірне розподілення поживних речовин і кисню в культуральній рідині. Твердо-фазове культивування не є оптимальним для цього штаму, оскільки воно обмежує доступ до поживних речовин і кисню. Періодичне, безперервне чи напівбезперервне культивування. Оскільки лізин є вторинним метаболітом і його синтез розпочинається у стаціонарній фазі росту, періодичне культивування є найбільш ефективним способом для отримання цього продукту. Під час стаціонарної фази мікроорганізми починають інтенсивно синтезувати лізин. Безперервне культивування в цьому випадку не дає оптимальних результатів, оскільки синтез лізину може знизитись, і продуктивність буде менша через зменшення концентрації субстрату в середовищі. Параметри біосинтезу: оптимальний pH для росту Micromonospora inyoensis і біосинтезу лізину становить 4,0–4,5; оптимальна температура для цього штаму — 45–55°C, що відповідає термофільним властивостям; важлива для забезпечення киснем аеробного мікроорганізму для росту та синтезу. Зважаючи на вищезазначене, оптимальними умовами культивування для синтезу лізину є аеробне, асептичне культивування з підживленням, за допомогою глибинного методу при оптимальних значеннях pH та температури. Періодичне культивування є найбільш підходящим способом для отримання високої концентрації лізину. Отже, культивування Micromonospora inyoensis для синтезу лізину повинно проводитися в аеробних, умовно асептичних умовах з підживленням, за допомогою глибинного методу культивування при оптимальних параметрах pH та температури, з використанням періодичного способу для досягнення максимальної ефективності біосинтезу. 3.2 Вибір типу ферментера При виборі типу ферментера для біосинтезу лізину з використанням Micromonospora inyoensis важливо врахувати кілька факторів, що забезпечують оптимальні умови для росту мікроорганізмів та ефективного синтезу продукту. Основними критеріями для вибору ферментера є рівень турбогіпобіозу, потреба у розчиненому кисні, а також можливість ефективного перемішування і аерації. Для культивування Micromonospora inyoensis, який є аеробним мікроорганізмом, оптимальним вибором є ферментер з інтенсивною аерацією та регульованим перемішуванням. Оскільки цей штам не утворює міцеліїв, як це характерно для деяких інших мікроорганізмів, надлишкові зрізові зусилля не завдають йому значної шкоди. Проте важливо забезпечити необхідний рівень кисню для ефективного аеробного біосинтезу, оскільки дефіцит кисню може обмежити ріст і синтез лізину. Для цього у ферментері повинна бути налаштована інтенсивність аерації, що відповідає потребам штаму у розчиненому кисні. У зв'язку з тим, що синтез лізину є аеробним процесом, для забезпечення максимальної інтенсивності масопереносу кисню, ферментер має бути оснащений перемішувальним пристроєм, який здатен ефективно перемішувати культуральну рідину без надмірних зрізових зусиль. Для цього оптимальним є вибір ферментера з регульованою кількістю обертів перемішувального пристрою, що дозволяє підтримувати необхідний рівень аерації на різних етапах культивування, в залежності від потреб мікроорганізмів та в'язкості рідини. Таким чином, для культивування Micromonospora inyoensis з біосинтезом лізину доцільно використовувати ферментер з контролем аерації і перемішування, що забезпечить ефективний масообмін і збереження оптимальних умов для росту мікроорганізмів і синтезу продукту. 3.3 Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу Об'єм виробничого ферментатора становить 100 м³, а коефіцієнт заповнення ферментатора — 0,5. Таким чином, об'єм культуральної рідини, який буде використовуватися для культивування, становить: 100м3×0,5=50м3 Припустимо, що для підготовки посівного матеріалу використовується інокулят у об'ємі 2 л (максимальний об'єм для колби на качалці). Тепер, враховуючи, що один інокулят займає 2 л, потрібно визначити кількість таких порцій для досягнення необхідного об'єму культуральної рідини: 50м3=50,000л Кількість порцій інокуляту для заповнення ферментатора: = 25,000 порцій Отже, для отримання необхідного об'єму культуральної рідини (50 м³) необхідно приготувати 25,000 порцій посівного матеріалу по 2 л кожна. Таким чином, кількість стадій підготовки посівного матеріалу для культивування в 50 м³ ферментаторі дорівнює 25,000 порцій. Як показано в табл. 3.1, для ферментера об'ємом 100 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,5, робочий об'єм складе 50 м³, з яких 5 м³ будуть використовуватися для посівного матеріалу, 5 м³ - для конденсату, а об'єм підготовки поживного середовища складе 60 м³. Таблиця 3.1 Результати розрахунку об’ємів ферментаційного обладнання для підготовки посівного матеріалу і виробничого біосинтезу Отже, процес одержання посівного матеріалу для забезпечення виробничого біосинтезу у ферментері об’ємом 100 м³ з коефіцієнтом заповнення 0,5 буде проходити у п’ять етапів (рис. 3.1). Рис. 3.1  Схема багатоступеневого приготування посівного матеріалу А – вирощування у флаконах, Б – вирощування у колбах на качалках: 1 – законсервований вихідний матеріал; 2 – спорова генерація на скошеному агарі в пробірці; 3 – II спорова генерація на твердому середовищі; 3а і 3б – I і III генерації на рідкому середовищі в колбі; 4 – ферментер попереднього інокулювання; 5 – ферментер інокулювання; 6 – основний ферментер 3.4 Особливості підготовки і стерилізації поживного середовища для одержання посівного матеріалу і виробничого біосинтезу Для забезпечення ефективного біосинтезу лізину за допомогою Micromonospora inyoensis, необхідно правильно підготувати та стерилізувати поживне середовище, зокрема розділити компоненти на композиції для уникнення негативних хімічних реакцій під час стерилізації. У процесі підготовки середовища враховуються особливості кожного компонента та вимоги до стерилізації, що дозволяють уникнути утворення осадів або зниження ефективності середовища. Композиції для стерилізації Згідно з вимогами, компоненти середовища для інокуляту і для виробничого біосинтезу слід розділяти на композиції в залежності від температури та часу стерилізації. Наприклад, вуглеводи, деякі амінокислоти, вітаміни та солі стерилізуються при температурі 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20–30 хв, а розчини солей при 131°C (0,15 МПа) протягом 40–60 хв. Соли кальцію і магнію, як у випадку фосфатних солей, слід стерилізувати окремо, щоб уникнути утворення нерозчинних фосфатів кальцію і магнію. Для цього важливо підтримувати рН середовища на рівні 4,5–5,0 перед стерилізацією. Підготовка поживного середовища для посівного матеріалу Для приготування поживного середовища для посівного матеріалу важливо враховувати, що компоненти, які легко піддаються мікробній контамінації (наприклад, вуглеводи), необхідно підготувати в розчинах з максимально можливою концентрацією (наприклад, 40%-ві розчини вуглеводів). В такому випадку також слід підготувати підживлювальні розчини з відповідною концентрацією, що дозволяє контролювати рівень вуглецю в процесі культивування. Стерилізація поживного середовища Стерилізація поживного середовища для культивування мікроорганізмів повинна проводитися при температурі 131°C в автоклаві, щоб забезпечити знищення всіх можливих контамінантів. Однак, якщо стерилізація середовища здійснюється у ферментаторі, перед стерилізацією компоненти повинні бути змішані в реакторі, а рН доведене до оптимального рівня за допомогою стерильного розчину кислоти або лугу. Приготування розчинів для титрувальних агентів У разі необхідності коригування рН середовища під час культивування, використовуються титрувальні агенти (соляна кислота, гідроксид натрію). Для підкислення середовища до рН 4,5 зазвичай готується 6% розчин соляної кислоти, який після стерилізації додається до середовища. Для підлуження середовища використовуються розчини лугу (зазвичай 6% розчин гідроксиду натрію). Особливості підготовки та стерилізації підживлювальних розчинів Якщо культивування передбачає дробне внесення субстрату (підживлення), підживлювальні розчини повинні готуватися в окремих реакторах і стерилізуватися відповідно до вимог для кожного компоненту. Це дозволяє уникнути утворення осадів та забезпечити ефективний біосинтез лізину. Освітлення меляси та підготовка розчину для гідролізу Освітлення меляси, якщо вона використовується, передбачає підготовку розчину сірчаної кислоти та центрифугування для відділення осаду сульфату кальцію. Для процесу гідролізу меляси, після додавання сірчаної кислоти до меляси до рН 4–4,5, середовище стерилізується при 112°C без подальшого відділення осаду. Як показано в табл. 3.2, для приготування поживного середовища об'ємом 50 л необхідно розчинити 100 г глюкози в воді, стерилізуючи при 112°C, а також підготувати амонійні солі та фосфатні солі, стерилізуючи їх при 131°C, з використанням відповідних ємностей для внесення компонентів. Як показано в табл. 3.3, для різних об’ємів поживного середовища необхідні різні концентрації мікроелементів, таких як залізо, мідь, цинк, марганець, кобальт і молібден, зокрема, для об'єму 50 л використовуються 0,05 г заліза та 0,01 г міді. Таблиця 3.2 Розрахунок вмісту та особливості приготування деяких компонентів поживного середовища Таблиця 3.3 Розрахунок вмісту мікроелементів в різних об’ємах поживного середовища 3.4.1 Вирощування інокуляту в колбах на качалках Проаналізувавши склад поживного середовища для вирощування Micromonospora inyoensis для біосинтезу лізину, умовно ділимо його на такі композиції, залежно від режиму стерилізації компонентів: Композиція А: Глюкоза (C₆H₁₂O₆), амонійні солі (NH₄Cl, NH₄NO₃), фосфатні солі (K₂HPO₄, KH₂PO₄) (режим стерилізації: стерилізація при 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20-30 хв). Композиція Б: Солі кальцію (CaCl₂), магнію (MgSO₄ · 7H₂O) (режим стерилізації: стерилізація при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хв). Композиція В: Калій (K₂SO₄), залізо (FeSO₄ · 7H₂O), кальцій (CaCl₂) (режим стерилізації: стерилізація при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хв). Для вирощування інокуляту в колбах на качалках, спочатку підготовлені компоненти поживного середовища діляться на композиції в залежності від режиму стерилізації. Композицію А стерилізують при 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20–30 хв, щоб забезпечити ефективну стерилізацію без втрати корисних властивостей компонентів. Композиція Б стерилізується при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40–60 хв, оскільки ці компоненти потребують більш високої температури для знищення мікробних контамінантів. Композиція В також стерилізується при 131°C, щоб уникнути утворення нерозчинних осадів, таких як сульфат кальцію. Після стерилізації всі компоненти об’єднуються в стерильному середовищі, після чого додається інокулят для подальшого культивування в колбах на качалках, де підтримуються оптимальні умови для росту та синтезу лізину. 3.4.2 Вирощування інокуляту в посівних апаратах Стерилізація 50 л та 200 л поживного середовища, необхідних для цих стадій вирощування інокуляту, здійснюється у відповідних посівних апаратах, що потребує перескладання композицій поживного середовища. Оскільки у таких об'ємах може відбутися утворення осадів при стерилізації солей кальцію і магнію, компоненти середовища повинні бути об'єднані в окремі композиції для уникнення негативних хімічних реакцій. Композиція А: Глюкоза (C₆H₁₂O₆), амонійні солі (NH₄Cl, NH₄NO₃), фосфатні солі (K₂HPO₄, KH₂PO₄) — стерилізація при 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20-30 хв. Композиція Б: Солі кальцію (CaCl₂), магнію (MgSO₄ · 7H₂O) — стерилізація при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хв. Композиція В: Калій (K₂SO₄), залізо (FeSO₄ · 7H₂O), кальцій (CaCl₂) — стерилізація при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хв. Після стерилізації кожна композиція об’єднується в посівних апаратах, де середовище охолоджується до оптимальної температури, і додається інокулят для подальшого культивування. 3.4.3 Виробничий біосинтез Середовище для виробничого біосинтезу в ферментаторі об’ємом 100 м³ ділять на такі композиції: Композиція А: Глюкоза (C₆H₁₂O₆), амонійні солі (NH₄Cl, NH₄NO₃), фосфатні солі (K₂HPO₄, KH₂PO₄) — стерилізація при 112–115°C під тиском 0,05 МПа протягом 20-30 хв. Композиція Б: Солі кальцію (CaCl₂), магнію (MgSO₄ · 7H₂O) — стерилізація при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хв. Композиція В: Калій (K₂SO₄), залізо (FeSO₄ · 7H₂O), кальцій (CaCl₂) — стерилізація при 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40-60 хв. Після стерилізації, кожна композиція об'єднується у ферментаторі, де підтримуються оптимальні умови для біосинтезу лізину та росту Micromonospora inyoensis. Отже, технологічна схема, окрім стадій підготовки поживного середовища, включає такі додаткові стадії: стадія стерилізації компонентів поживного середовища, що потребує стерилізації при різних температурах і тисках в залежності від складу композицій (глюкоза, амонійні солі, солі кальцію і магнію, тощо); стадія приготування підживлювальних розчинів для процесу культивування з дробним внесенням субстрату; стадія охолодження середовища після стерилізації перед внесенням інокуляту та коригування рН до оптимального рівня для біосинтезу. Крім того, необхідно передбачити такі реактори: реактор для приготування розчинів титрувальних агентів (кислоти та лугу), щоб коригувати рН середовища під час стерилізації і після неї; реактор для стерилізації середовища (якщо стерилізація здійснюється поза ферментатором), щоб забезпечити рівномірну стерилізацію великих об’ємів середовища; реактор для приготування підживлювальних розчинів, що використовуються під час культивування з дробним внесенням субстрату; реактор для освітлення меляси (якщо використовується цей компонент), який забезпечує відділення осаду сульфату кальцію перед подачею до ферментатора. Ці додаткові стадії та реактори необхідні для забезпечення безперебійної та ефективної роботи процесу біосинтезу в умовах виробничого масштабування. РОЗДІЛ 4. ОПИС ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ У цьому розділі детально описуються кожна стадія і операція технологічного процесу, включаючи підготовку поживного середовища, вирощування інокуляту, проведення виробничого біосинтезу та контроль якості. Всі стадії та операції нумеруються згідно з їх виконанням у технологічному процесі, починаючи з підготовки середовища і закінчуючи отриманням кінцевого продукту. ДР 2. Приготування і стерилізація поживних середовищ ДР 2.1. Приготування і стерилізація поживного середовища для колб Розрахунок необхідних кількостей компонентів для приготування середовища для вирощування посівного матеріалу в колбах на качалках наведено в табл. 4.1. Таблиця 4.1 Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці ДР 2.1.1. Приготування і стерилізація композиції А Композиція А включає глюкозу (C₆H₁₂O₆) та солі кальцію (CaCl₂). Для приготування 3 л середовища необхідно 300 г глюкози та 1,5 г солей кальцію. Стерилізація цієї композиції проводиться при температурі 112°C під тиском 0,05 МПа протягом 20–30 хв. ДР 2.1.2. Приготування і стерилізація композиції Б Композиція Б містить амонійні солі (NH₄Cl, NH₄NO₃) та магній (MgSO₄·7H₂O). Для приготування 3 л середовища необхідно 15 г амонійних солей та 0,9 г магнію. Стерилізація цієї композиції здійснюється при температурі 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40–60 хв. ДР 2.1.3. Приготування і стерилізація композиції В Композиція В включає фосфатні солі (K₂HPO₄, KH₂PO₄), калій (K₂SO₄) та залізо (FeSO₄·7H₂O). Для приготування 3 л середовища необхідно 9 г фосфатних солей, 0,3 г калію та 0,15 г заліза. Стерилізація цієї композиції здійснюється при температурі 131°C під тиском 0,15 МПа протягом 40–60 хв. Розрахунок необхідних кількостей компонентів для приготування середовища для вирощування інокуляту в інокуляторі об’ємом 63 л наведений у табл. 4.2. Таблиця 4.2 Композиції стерилізації компонентів для вирощування посівного матеріалу в інокуляторі об’ємом 63 л (Кз = 0,5) ТП 3.1. Підтримання колекційної культури Micromonospora inyoensis Отриману колекційну культуру Micromonospora inyoensis зберігають у пробірці на скошеному щільному агаризованому середовищі (МПА – м’ясо–пептонний агар) в темряві при температурі 4±2°C. Пересіви на свіже поживне середовище проводять 1–2 рази на місяць. Всі роботи з колекційною культурою виконуються в асептичних умовах, щоб запобігти контамінації. ТП 3.2. Одержання робочої культури Micromonospora inyoensis Колекційну культуру методом виснажувального штриха пересівають на чашку Петрі з МПА для отримання ізольованих колоній. Культивують в термостаті при t = 30±1°C протягом 48 годин. Це дозволяє отримати достатню кількість чистих колоній для подальшого вирощування. ТП 3.3. Вирощування інокуляту на агаризованих поживних середовищах Отримані ізольовані колонії з чашки Петрі (від ТП 3.2) пересівають петлею в пробірки зі скошеним МПА (одна ізольована колонія використовується для засіву однієї пробірки). У пробірки пересівають ізольовані колонії, що знаходяться на відстані не менше 1 см одна від одної. Культивують в термостаті при t = 30±1°C протягом 24 годин. ТП 3.4. Вирощування інокуляту в колбах на качалках В асептичних умовах у колбу об’ємом 3 л з стерильною композицією А (від ДР 2.1.1) зливають простерилізовані композиції Б, В, Г (від ДР 4.1.2.–4.1.4.), перемішують і розливають по 150 мл у качалочні колби об’ємом 750 мл. У пробірку з робочою культурою Micromonospora inyoensis (від ТП 3.3) вносять 5 мл фізіологічного розчину, суспендують клітини, піпеткою відбирають одержану бактеріальну суспензію і вносять у качалочні колби з поживним середовищем. Для засіву однієї колби використовують бактеріальну суспензію, одержану з однієї пробірки. Культивують на качалках (320 об/хв) при t = 30±1°C протягом 24 годин. ТП 3.5. Вирощування інокуляту в інокуляторі об’ємом 63 л В асептичних умовах у спеціальний балон для асептичної передачі зливають розчин меляси (від ДР 2.2.2.), дріжджового автолізату і пантотенату (від ДР 2.2.3.), перемішують і отриманий розчин асептично через конектор передають в інокулятор з розчином солей (від ДР 2.2.1.). Вмикають перемішуючий пристрій і доводять рН середовища до 7,0 за допомогою 6%-го розчину КОН (від ДР 1.3.1.) за показником датчика рН. Через засівну колбу вносять 3 л посівного матеріалу від ТП 3.4. Культивують до концентрації біомаси 3,7 г/л при t = 30±1°C з частотою обертів перемішуючого пристрою 320 об/хв і постійною аерацією (значення рО2 = 20–30 % від насиченого повітря) протягом 16 годин. ТП 7.1. Виробничий біосинтез (отримання культуральної рідини) У попередньо простерилізований ферментер об’ємом 63 м³ перекачують простерилізоване поживне середовище (від ДР 2.5.2.). За допомогою відцентрового насосу з магнітною муфтою в ферментер з реактора–змішувача подають соняшникову олію (від ДР 2.5.1.). Вмикають перемішуючий пристрій і доводять рН середовища до 7,0 за допомогою 6%-го розчину КОН (від ДР 1.3.4.) за показником датчика рН. Через трубу перетискування перекачують з інокулятора інокулят від ТП 3.7. Культивують до концентрації полісахариду етаполану та біомаси 10,4 і 7,3 г/л, відповідно, при t = 30±1°C з частотою обертів перемішуючого пристрою 320 об/хв і постійною аерацією (значення рО2 = 20–30 % від насиченого повітря) протягом 33 годин. РОЗДІЛ 5. КОНТРОЛЬ ВИРОБНИЦТВА 5.1 Мікробіологічний контроль У процесі біосинтезу лізину за допомогою Micromonospora inyoensis необхідно здійснювати мікробіологічний контроль для забезпечення відсутності контамінації та підтвердження чистоти культури. Контроль проводиться на кожній стадії культивування, починаючи з підготовки посівного матеріалу і закінчуючи виробничим біосинтезом. Методика мікробіологічного контролю Прямий висів на агаризовані середовища Кожні 4–8 годин відбираються зразки культуральної рідини з інокулятора та ферментера для аналізу. Зразки висівають на чашки Петрі з м'ясо-пептонним агаром (МПА) для виявлення бактерій і на глюкозо-картопляний агар (ГКА) або сусло-агар для виявлення грибів та дріжджів. Це дозволяє виявити можливі контамінації в процесі вирощування. Мікроскопія Для приготування препарату на чисте знежирене предметне скло наносять невелику кількість культуральної рідини за допомогою стерильної петлі. Мазок висушується при кімнатній температурі. Після висихання наноситься 1–2 краплини імерсійного масла, після чого препарат спостерігається під мікроскопом з імерсійною системою. У разі відсутності контамінацій, клітини Micromonospora inyoensis будуть мати паличкоподібну форму, розташовані парами або невеликими ланцюжками. Морфологічні ознаки клітин Micromonospora inyoensis Форма клітин: паличкоподібна (товсті короткі палички в експоненційній фазі росту), кокоподібна в стаціонарній фазі. Розмір клітин: 0,95–1,5×1,2–2,0 мкм. Клітини нерухливі, спор не утворюють, грамнегативні. Особливості контролю анаеробних мікроорганізмів У разі культивування анаеробних мікроорганізмів, мікробіологічний контроль здійснюється у товщу агаризованого середовища, оскільки анаеробні бактерії не можуть рости на поверхні середовища без забезпечення спеціальних умов (анаеробний бокс). 5.2 Показники росту і синтезу цільового продукту Методика визначення концентрації біомаси та цільового продукту: Визначення концентрації біомаси: Для визначення концентрації біомаси, культуральну рідину необхідно відцентрифугувати, після чого осад біомаси висушується і зважується. Це дозволяє точно визначити кількість мікроорганізмів, що ростуть у середовищі. Визначення концентрації цільового продукту (лізину): Для визначення концентрації лізину використовуються методи хроматографії (газорідинна або високоефективна рідинна хроматографія). Перед аналізом біомасу необхідно відділити від культуральної рідини, а цільовий продукт виділити з супернатанту. Лізин аналізується на хроматографі після екстракції або осадження з культуральної рідини. Технологічні показники контролю: Концентрація лізину. Концентрація джерел вуглецю та азоту в середовищі. Вміст етанолу, глюкози, амонійних солей, нітратів та інших компонентів середовища. Особливості визначення джерел вуглецю і азоту Для аналізу джерел вуглецю (глюкоза, етанол) та азоту (амонійний, нітратний азот) використовуються специфічні методи хімічного аналізу. Важливо враховувати, що культуральна рідина є багатокомпонентною системою, тому потрібно визначати ці речовини саме в умовах, коли вони взаємодіють у середовищі. Періодичність відбору проб Проби відбираються кожні 4–8 годин, в об’ємі 150–200 мл. Відібрані проби аналізуються як за мікробіологічними, так і за технологічними показниками (концентрація цільового продукту, джерела вуглецевого та азотного живлення). Контроль вмісту компонентів середовища Визначення концентрації моносахаридів (наприклад, глюкози) проводиться за допомогою методів, що дозволяють точно аналізувати рівень глюкози у культуральній рідині без помилок, викликаних присутністю інших цукрів чи полісахаридів. Для визначення джерел азоту використовуються методи, які дозволяють відокремити вплив біомаси та метаболітів на результат аналізу. 5.2.1 Концентрація біомаси Концентрація біомаси є важливим показником для моніторингу процесу біосинтезу та оцінки ефективності росту мікроорганізмів. Для визначення концентрації біомаси в культуральній рідині використовується метод центрифугування з подальшим зважуванням осаду. Процедура визначення концентрації біомаси Відбір проби: Відібрати зразок культуральної рідини (150–200 мл) на кожній стадії культивування (наприклад, кожні 4–8 годин). Центрифугування: Помістити відібрану пробу в центрифужні трубки та центрифугувати при 4000–6000 об/хв протягом 10–15 хвилин. Це дозволяє осадити біомасу з культуральної рідини. Висушування біомаси: Після центрифугування зливати супернатант (жидку частину) і залишити осад. Осад з біомасою сушать в сушильній шафі при температурі 60–70°C до досягнення сталої маси (не менше 24 годин). Зважування: Після висушування осаду, зважують суху біомасу на аналітичних вагах. Для точного вимірювання біомаси можна використовувати спеціальні лабораторні ваги з точністю до 0,001 г. Розрахунок концентрації біомаси Концентрація біомаси визначається як маса сухої біомаси, виражена в грамах на літр культуральної рідини: Концентрація біомаси (г/л)= Контроль: Для забезпечення точності вимірювання важливо дотримуватися чітких умов при відборі проб, центрифугуванні та висушуванні біомаси. Результати контролю концентрації біомаси використовуються для подальших технологічних розрахунків та оцінки ефективності процесу культивування. Періодичність відбору проб: Проби відбираються кожні 4–8 годин для оцінки змін у концентрації біомаси на різних етапах культивування. 5.2.2 Концентрація цільового продукту Для визначення концентрації цільового продукту (в даному випадку лізину або іншого вторинного метаболіту, що синтезується мікроорганізмами) у культуральній рідині, використовуються методи екстракції та хімічного аналізу. Після відділення біомаси від супернатанту культуральної рідини можна застосовувати такі методи: Процедура визначення концентрації цільового продукту Відбір проби: Відібрати 150–200 мл культуральної рідини для аналізу концентрації цільового продукту. Проби відбираються на кожній стадії культивування, зазвичай кожні 4–8 годин. Відділення біомаси: Центрифугувати зразок культуральної рідини для відділення біомаси (як описано в розділі 5.2.1). Після центрифугування зливати супернатант і обробляти його для подальшого аналізу. Екстракція цільового продукту: В залежності від природи цільового продукту, використовують відповідні методи екстракції. Наприклад: Для водорозчинних продуктів, таких як амінокислоти (лізин), використовують екстракцію розчинниками або фільтрацію через спеціальні мембрани. Для органічних продуктів, таких як полісахариди чи екзополісахариди, застосовують методи осадження або осмотичної екстракції. Аналіз за допомогою хроматографії: Після екстракції цільовий продукт аналізується методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) або газорідинної хроматографії, що дозволяє точно визначити концентрацію цільового продукту в супернатанті. Розрахунок концентрації: Концентрація цільового продукту в культуральній рідині обчислюється як маса екстрагованого продукту, виражена в грамах на літр культуральної рідини: Концентрація цільового продукту (г/л) = ​ Періодичність відбору проб: Зразки відбираються кожні 4–8 годин протягом усього процесу культивування для моніторингу концентрації цільового продукту на різних етапах біосинтезу. 5.2.3 Концентрація джерела Карбону і Нітрогену Концентрація джерел вуглецю та азоту є важливим показником для моніторингу ефективності біосинтетичних процесів, оскільки вони є основними елементами для росту мікроорганізмів і синтезу цільового продукту. Основні джерела карбону (глюкоза, етанол) та азоту (амоній, нітрати) мають бути точно визначені. Процедура визначення концентрації джерел Карбону і Нітрогену Визначення концентрації джерела вуглецю (наприклад, глюкоза): Концентрація глюкози або інших вуглеводів визначається за допомогою методів, таких як [6]: фенол-сірчаний метод для моносахаридів (глюкоза); глюкозооксидазний метод для визначення глюкози в культуральній рідині. Визначення концентрації джерела азоту (наприклад, амоній, нітрати): Для визначення концентрації амонійних солей (NH₄Cl, NH₄NO₃) або нітратів (NO₃⁻) використовуються методи [14, с. 974]: Метод К’єльдаля для загального азоту в культуральній рідині. Колориметричні методи для визначення амонію та нітратів у рідкому зразку за допомогою спеціальних реагентів. Аналіз за допомогою хімічного аналізу: У випадку складних середовищ, де вміст вуглецю та азоту може змінюватися через взаємодії компонентів, використовують спеціалізовані аналізи для визначення концентрації цих компонентів у культуральній рідині. Методи можуть включати титрування або використання датчиків для безперервного моніторингу рівня карбону та азоту. Розрахунок концентрації джерел Карбону та Нітрогену Концентрація кожного з джерел розраховується за формулою: Концентрація джерела вуглецю (г/л) = Концентрація джерела азоту (г/л) = ​ Періодичність відбору проб: Проби для аналізу концентрації джерел карбону та азоту відбираються кожні 4–8 годин протягом усього процесу культивування. ЛІТЕРАТУРА ГОСТ 7.1-2006. Бібліографічний запис. Загальні вимоги та правила складання. К.: Держспоживстандарт України, 2006. Гігієна харчування: підручник / за ред. А. Я. Смірнова. – К.: Здоров’я, 2005. А.І. Федоренко, О. С. Гребенюк. Мікробіологія та біотехнологія. – К.: Академія, 2010. Н. В. Іванова, В. А. Володіна. Біохімія мікроорганізмів. – К.: Вища школа, 2009. Біотехнологія: основи теорії та практики: підручник / за ред. В. Г. Моллі. – К.: Вища школа, 2007. Курс біотехнології / І. В. Шевченко, А. І. Мельник. – Харків: ХНУ, 2011. ISO 7218:2007. Мікробіологічні методи для харчових продуктів та кормів. Загальні принципи та вимоги до лабораторії. – Женевa, 2007. Технологія мікробного синтезу: навч. посібник / за ред. М. О. Коваленка. – Львів: ЛНУ, 2012. Sambrook, J., Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition. – Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Patel, S.K.S., and Ghosh, S. Microbial production of bioactive compounds and their applications. – Springer, 2018. Приймак, О. С. Культивування Micromonospora purpurea для одержання гентаміцину : кваліфікаційна робота ... бакалавра : 162 Біотехнології та біоінженерія / Оксана Сергіївна Приймак ; наук. керівник Юрій Миколайович Пенчук. – Київ, 2021. – 71 с. Антибіотики останнього покоління та їх використання в медицині України [Електронний ресурс] // Центральна Всеукраїнська бібліотека. – Режим доступу: http://xn--80aja6bcnk.com.ua/referati/24-medicina/1137-referat-na-temuantibiotikiostannogo-pokolinnja.html Satoko Yoshizawa et al. Structural origins of gentamicin antibiotic action. The EMBO Journal (1998) 17, 6437 — 6448. doi:10.1093/emboj/17.22.6437 M.Rajasimman and S.Subathra. Process Parameter Optimization for the Production of Gentamicin using Micromonouspora Echiniospora Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry, 2010; 37( 1): 973-975 . Gonzalez, Laura Islas, Ana-Maria Obregon, Laura Escalante and Sergio Sanchez. Gentamicin Formation in Micromonosporapurpurea: Stimulatory Effect of Ammonium. E JOURNAL OF ANTIBIOTICS, 1995; 48( 6): 479-482. Micromonospora echinospora на агаризованих поживних середовищах [Електронний ресурс] : режим доступу https://bacdive.dsmz.de/strain/7972 ДОДАТКИ Додаток А Апаратно-технологічна схема Додаток Б Технологічна схема Додаток В